唐冰雯，郭俐麟

(广州卫生职业技术学院，广东 广州 510450)

止咳宝片是由紫菀、橘红、百部、桔梗、枳壳、陈皮、罂粟壳浸膏等十四味药材制成的中药成方制剂，具有宣肺祛痰、止咳平喘的功效[1]，可用于外感风寒所致的咳嗽、痰多清稀、咳甚而喘。止咳宝片中主要镇咳成分为罂粟壳浸膏里的吗啡，另一主要镇咳成分为黄酮类物质，其中以橘红、陈皮中的主要化学成分橙皮苷为代表。现行《中国药典》采用高效液相色谱法测定了止咳宝片中的无水吗啡的含量以控制止咳宝片的含量[1]。而对另一主要镇咳成分橙皮苷的定量却无明确规定，缺乏一定的科学性。同时可查到的关于止咳宝片的质量控制文献寥寥无几。仅有古星妙等[2]等在药典基础上优化流动相和检测波长，以此测定止咳宝片中吗啡的含量。李小燕等[3]采用氮测定法(蒸馏法)，测定止咳宝片中氯化铵的含量。但是，止咳宝片中有关橙皮苷的含量测定尚仍未见文献报道。因此，本研究拟建立一种准确、简便快速的定量分析方法来控制止咳宝片中橙皮苷的含量，以进一步提高和完善止咳宝片的质量标准。

1 仪器与试剂

仪器:安捷伦1260高效液相色谱仪，XHDZF-系列真空干燥箱(上海霄汉实业发展有限公司)，SHB-III循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)，FA1104A万分之一电子天平(上海精天电子仪器有限公司)，KQ5200超声提取器(昆山市超声仪器有限公司)。

试剂: 止咳宝片3批，广东台城制药股份有限公司，批号为20160404，20160937，20161033；橙皮苷对照品(批号110721-201316)，中国食品药品检定研究院；乙腈(色谱纯)，甲醇(色谱纯)，购自德国默克股份有限公司；无水乙醇(分析纯)，磷酸(分析纯)，甲醇(分析纯)，均购自广州化学试剂厂。

2 方法与结果

2.1 样品制备

2.1.1 对照品溶液的制备

精密称取橙皮苷对照品27.2mg，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液(橙皮苷浓度为272μg·mL-1)。

2.1.2 供试品溶液的制备

取本品除去包衣，研细，取约0.2g，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇溶液20mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，称重，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，弃去初滤液，续滤液用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即为供试品溶液。

2.1.3 阴性对照液的制备

取处方组成中除橘红、枳壳、陈皮外的其余成分制成不含橘红、枳壳、陈皮的阴性对照品，按“2.1.2”项下的制备方法处理得阴性対照液。

2.2 色谱条件

Diamond-C18(150mm×4.6mm,2.7μm)色谱柱，流动相∶乙腈-水(21∶79)，检测波长为283nm；流速1.0mL·min-1；柱温35℃；进样量5μL。取对照品溶液(橙皮苷浓度为21.76μg·mL-1)、供试品溶液、阴性对照溶液，分别进样，记录色谱图，结果见图1。理论塔板数按橙皮苷计应不低于2000；保留时间为7.202min；与相邻峰的分离度大于1.5；拖尾因子为1.05；阴性对照样品对供试液溶液检测无干扰，说明该方法专属性强。

A.样品(Sample);B.对照(Standard);C.阴性(Negative)图1 对照品、样品及阴性的高效液相色谱图

2.4 方法学考察

2.4.1 标准曲线制备

分别吸取0.1，0.3，0.4，0.5，0.7，1.0mL的橙皮苷对照品储备液，置5mL量瓶中，加甲醇稀释成橙皮苷浓度为5.44、16.32、21.76、27.20、38.08、54.40μg·mL-1的溶液。依次进样10μL，每个浓度测定3次以上。以峰面积(A)为对照品溶液系列浓度(C)进行回归，得橙皮苷回归方程A=9.0463C-7.7933，相关系数r=0.9990.表明橙皮苷浓度在5.44～54.40μg·mL-1之间与峰面积线性关系良好。结果见表1。

表1 橙皮苷的线性与范围

2.4.2 检测限与定量限

取“2.1.1”配置的橙皮苷对照品溶液，逐级稀释，检测限是以信噪比(S/N)时各对照品进样质量浓度，定量限是以信噪比(S/N)为10时对照品进样质量浓度。结果橙皮苷的检测限、定量限分别为0.0816μg·mL-11、0.272μg·mL-1。

2.4.3 精密度实验

取“2.4.1”配制的系列浓度的中间浓度(橙皮苷浓度为21.76μg·mL-1)，按照“2.2”项下的方法连续进样5次，记录橙皮苷峰面积。结果，橙皮苷峰面积的平均值为192.1，RSD为0.26%，表明仪器精密度良好(见表2)。

表2 精密度试验结果

2.4.4 稳定性实验

取供试品溶液(批号：20161033)在0，2，4，6，8，12h分别进样5?l，记录峰面积，结果橙皮苷峰面积的平均值为191.2，RSD为0.38%，表明供试品溶液在12h内稳定。结果见表3。

2.4.5 重复性实验

取同一批号(批号：20161033)样品6份，按“2.1.2”方法提取、测定，结果橙皮苷平均质量浓度为2.757mg·g-1，RSD为1.9%。表明分析方法重复性良好。结果见表4。

2.4.5 加样回收实验

精密称取同一批号样品(批号：20161033)共6份，加入相应量的橙皮苷对照品，照“2.1.2”方法处理并按“2.2”项下测定，计算回收率，结果见表5。橙皮苷平均回收率为102.6%，RSD=1.5%。结果表明本方法准确可靠。

2.5 样品测定

取3批样品(批号：20160404；20160937；20161033)，按“2.1.2”项下制备供试品溶液，按“2.2”项下方法进行测定，结果见表6。

表6 样品测定结果(mg·g-1，n≥3)

3 讨论

3.1 提取条件

本实验考察了分别以甲醇，乙醇为溶剂时对待测成分含量测定提取的影响，从结果看出以乙醇为溶剂时提取率较高，同时考察了不同浓度的乙醇(50%、70%)的影响，从结果看出70%乙醇作溶剂时提取率更高。同时，本实验还考察了超声30min、回流30min两种不同提取方式，结果显示该两种提取方式的提取效果基本一致，且考虑到超声提取方法具有明显的简洁性，所以采用超声法进行提取。另外，实验还考察了超声15、30、45min时待测成分含量的变化，结果表明30min的提取效果较好。故选择提取条件为70%乙醇超声提取30min。

3.2 色谱条件

经过文献查阅和参考[4-6]，本实验考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水流动相体系，结果显示采用甲醇-水体系时柱压太大且峰的保留时间过长，色谱峰面积减少，为了延长色谱柱使用寿命及改善色谱条件以更好地分离橙皮苷，加上乙腈的洗脱能力大于甲醇，且甲醇的分离效果一般，故采取乙腈作为流动相。而采取乙腈-0.1%磷酸水比例时杂质峰太多，间接造成待测组分色谱峰与相邻杂峰不完全分开。而乙腈-水体系能够将待测组分与杂质峰分开得较为令人满意，在保证符合标准的情况下，乙腈-水的效果好于乙腈-0.1%磷酸水。本实验还考察了流动相中不同浓度的乙腈(20%、21%)，结果显示采用21%乙腈-水系统的待测组分色谱峰与杂质峰分离度最好，柱效高，故流动相确定为21%乙腈-水系统。通过二极管阵列检测器200～400nm全波长扫描，发现橙皮苷的最大吸收波长为283nm，为提高灵敏度，检测波长选择283nm。本实验还考察了柱温的选择(30,35,40℃)，结果表明柱温30℃时提取率较低，柱温40℃时峰宽太大，而柱温为35℃时组分色谱峰与相邻杂峰分离度最好，因此柱温选择35℃。故，本次实验的色谱条件是流动相为21%乙腈-79%水系统，柱温为40℃，检测波长为283nm。

3.3 小结

由橙皮苷的测定结果可知，RSD不大于2%，说明结果准确。三批止咳宝片中橙皮苷的含量分别为2.854,3.318,2.757 mg·g-1，说明三批止咳宝片样品含量相差不大，说明该厂商制剂工艺较成熟，生产该制剂的质量比较稳定。

4 结论

本实验利用高效液相色谱法测定止咳宝片中橙皮苷的含量，方法简单、快捷，可为进步一完善止咳宝片的质量控制提供重要的依据。