王晓颖，王福琳，陆 远，岳辉莹，韩茂森，周广鹏

(山东中医药大学，山东 济南 250355)

栀子(Gardenia jasminoides Ellis )为茜草科植物栀子的干燥成熟果实，收录于《中华人民共和国药典》(2015版)。具有泻火除烦，清热利湿，凉血解毒的功效，外用消肿止痛。栀子果实系传统中药，亦属卫生部颁布的第一批药食两用资源，具有护肝、利胆、降压、止血、清热等作用[1]。研究发现栀子中含有大量化学成分，主要包括环烯醚萜、三萜、黄酮、挥发油、有机酸脂、微量元素及多糖。研究证明多糖有抗肿瘤、抗病毒、抗凝血、抗氧化[2-5]等多种作用，因此本文提取栀子多糖，并研究了其抗氧化与免疫促进的活性。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

1.1.1 实验材料

栀子购自宁夏华柯农业生态开发有限公司，无水乙醇、苯酚、硫酸均为分析纯，葡萄糖，抗坏血酸，DPPH试剂(福州飞净生物科技有限公司，纯度≥97%)，无菌双蒸水，羟自由基试剂盒、超氧阴离子试剂盒(南京建成生物科技有限公司)，RAW264.7细胞(购自商城北纳创联生物科技有限公司)，PBS，胎牛血清。

1.1.2 仪器

紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)、LGJ-18 冻干机( 北京四环科学仪器有限公司)、电子分析天平(上海民桥精密科学仪器有限公司) 、CO2培养箱、酶标仪(美国BioTek Instruments)。

2 方法与结果

2.1 栀子多糖正交提取工艺优化

2.1.1 正交实验设计

为优化栀子多糖提取工艺，参考文献[6-7]，适当整理调整后，选取温度(A)、料液比(B)、提取时间(C)、提取次数(D)为考察因素，各取三个水平，进行正交实验(详见表1)。每组实验均称取10g栀子果实粉末，按照正交实验设计因素水平表的条件(表1)进行提取，提取液浓缩后按2.1.2方法测定多糖含量。结果详见表2。

表1 因素水平表L9(34)

2.1.2 多糖含量测定

采用苯酚-硫酸法，根据已有文献[8-9]做适当调整。精确吸取0.15mg/mL的对照品溶液0，0.1 ，0.3，0.5 ，0.7，0.9 mL于6只具塞试管中，分别加蒸馏水补至2 mL，于上述试管中分别加入1 mL浓度为5%的苯酚溶液，摇匀，再各加入浓硫酸5 mL，充分摇匀后静置10 min，40℃下保温15min，取出后迅速将其冷却至室温。于490 nm(最大吸收波长λmax)处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标标准曲线。得到葡萄糖浓度(x)和吸光度(y)的关系式为y= 11.967x+0.00243，R2=0.9993，表明葡萄糖在0.015～0.135mg/mL的浓度范围内呈良好的线性关系，见图1。

图1 标准曲线

精密吸取供试品溶液1.0 mL于具塞试管中，按照上述标准曲线的绘制方法，自加入蒸馏水至2 mL起开始操作，测定吸光度，外标两点法测定多糖含量，计算多糖提取率。

2.1.3 提取工艺优化

正交实验结果及极差分析详见表2，方差分析详见表3。比较表2中极差R及k值的大小可知，影响栀子多糖提取率的因素主次顺序为：C>D>B>A。以R值最小的因素A(即温度)作为误差项进行方差分析[10]，可知因素C(即提取时间)、D(即提取次数)具显著性影响(P<0.05)，其余因素无显著性影响(P>0.05)。通过对表1和表2的综合分析，栀子多糖的最优提取工艺为：A3B2C1D2，即温度95℃，料液比1∶20，提取时间2h，提取次数3次。在此最佳工艺条件下，进行验证试验，栀子多糖的提取率为27%，优于正交实验表中其它组合项，表明该工艺可行，可作为栀子粗多糖的水提取工艺。采用热水提取，80%乙醇沉淀，得栀子多糖样品，用于下面的抗氧化和免疫活性实验。

表2 正交实验因素水平表L9(34)

表3 方差分析表

F0.05(2，2)=19.00 F0.01(2，2)=99.00

2.2 抗氧化实验

2.2.1 DPPH自由基清除能力

根据朱新如等[11]的方法，适当调整如下：精密称量DPPH，用70%乙醇配制成80μg/mL的溶液。用70%乙醇配制成多个梯度浓度的样品溶液(0，0.5，1，2，3，4mg/mL)，各取上述梯度浓度的样品溶液1mL，分别加入DPPH溶液2mL，避光反应30min，于517nm处测吸光度，平行测4次，结果取平均值，按照下面公式计算DPPH自由基清除率，另以70%乙醇作为空白，抗坏血酸(Vc)作阳性对照。结果见图2，栀子多糖对DPPH自由基具有一定清除作用，但作用不强，在浓度2mg/mL时DPPH自由基清除率为21.65%。

图2 DPPH自由基清除作用

2.2.2 羟基自由基清除能力

Fenton反应是最常见的产生羟基自由基的化学反应，消耗的H2O2的量和Fenton反应产生·OH的量成正比，当给予电子受体后，用Griess试剂显色，生成红色物质，其呈色与·OH 的量成正比关系。因此，可使用多功能读数仪在波长 550nm下测其吸光度，从而计算出提取物清除羟自由基的活力。

图3 羟基自由基清除作用

用双蒸水配置浓度梯度为2，4，8，10mg/mL的样品溶液，根据试剂盒说明书进行实验，将已有的0.8mL反应液在37℃下反应 1 min，立即加入显色剂2mL终止反应，混匀，室温放置20min后，双蒸水调零，在550nm处测定吸光度。按照下面公式计算羟基自由基清除率。另以双蒸水作为空白，抗坏血酸(Vc)作阳性对照(低浓度时羟基自由基清除率为39.41%)。结果如图3，栀子多糖对羟基自由基具有一定清除作用，且其清除作用随栀子多糖浓度的增大而增大，在浓度10mg/mL时羟基自由基清除率为70.97%。

2.2.3 清除超氧阴离子法测定抗氧化活性

模拟肌体中黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶反应系统，产生超氧阴离子自由基，加入电子传递物质及gress氏显色剂，使反应体系呈现紫红色，可用分光光度计测其吸光度。

用双蒸水配置系列梯度浓度为0.5，1，2，4，8，10mg/mL的样品溶液，根据试剂盒说明书进行实验，将现有的1.35mL反应液充分混匀，37℃恒温水浴40min，加入2mL显色剂，混匀，静置10min，双蒸水调零，在550nm处测定吸光度A值。另以双蒸水作为空白，抗坏血酸(Vc)作阳性对照。由图4可知，栀子粗多糖对超氧阴离子自由基具有清除能力，并呈剂量依赖关系，其中浓度为10mg/mL时，抑制率为19.26%。

图4 超氧阴离子抑制作用

2.3 RAW264.7巨噬细胞增殖作用

图5 栀子粗多糖对RAW264.7细胞增殖的影响

将RAW264.7细胞以1×105个/mL密度接种于96孔板中，于CO2培养箱中37℃培养24h，细胞贴壁后，加入不同浓度的多糖溶液(50，100，200，400μg/mL)100μL，同时设置空白对照组，每组设置5个复孔。恒温培养24h后，每孔加入20μL 5mg/mL的MTT，温育4h后，吸弃上清液，每孔加入150μL DMSO，震荡10 min后在570 nm 波长处测定其吸光度，计算细胞存活率。结果见图5，与空白组比较，在50～400μg/mL范围内的细胞存活率高于空白对照组，表明栀子多糖对RAW264.7巨噬细胞的增殖具有一定的促进作用，其中浓度为400μg/mL时对细胞的增殖作用最大，细胞存活率为139.45%。

3 讨论

采用水提法对栀子中所含的粗多糖进行提取，通过进行正交实验，确定了温度95℃，提取次数3次，料液比1∶20，提取时间2h为栀子多糖的最佳提取工艺条件，因素主次顺序为：提取时间>提取次数>料液比>温度。通过试验证明，该方法便捷有效，可为栀子多糖的进一步研究作参考。

根据清除DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基的实验可知，栀子多糖对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基皆具有一定的清除能力，但对于不同的自由基，其清除能力具有较大差距。其中，对羟基自由基的清除能力最强，其次为DPPH自由基和超氧阴离子自由基。由此可知，栀子多糖具有一定的体外抗氧化活性。根据MTT法测定细胞增殖实验可知，栀子粗多糖可促进RAW264.7巨噬细胞的增殖，且在一定范围内，其免疫作用随着浓度的增大而增大，表明栀子多糖具有一定的免疫活性。