俞颖 朱琳超 李强 姚轶敏

再生障碍性贫血（aplastic anemia，AA）是由免疫介导的造血干细胞及造血微环境损伤，从而导致骨髓造血功能衰竭的一种恶性血液疾病，以骨髓造血干细胞增生减低和外周血全血细胞减少为特征，以贫血、出血和感染为主要临床表现，病死率高。AA患者由于频繁输血，使机体铁沉积量过多，造成铁过载，导致多种脏器不同程度的损伤，且病程和预后与铁过载程度相关[1-2]。近年来，铁过载和免疫系统的关系受到越来越多的关注，免疫因素的介入会加剧铁过载对人体的危害[3-4]。淋巴细胞是机体免疫系统重要的免疫细胞，研究发现铁过载可通过升高活性氧（reactive oxygen species，ROS）来调节 T淋巴细胞数量和功能[5]。但关于AA患者铁过载对淋巴细胞影响的报道尚少，为此笔者回顾性分析AA患者临床资料和血清铁蛋白、血常规和淋巴细胞亚群等参数，旨在探讨铁过载对AA患者外周血淋巴细胞亚群的影响及其与铁过载程度的相关性。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2016年3月至2019年3月本院门诊或住院部收治的AA患者200例作为研究对象，患者均符合《血液病诊断及疗效标准》（第3版）中AA诊断标准[6]，所有患者均未经造血干细胞移植治疗，临床和实验室检查排除感染性疾病、免疫性疾病、骨髓移植和其他造血系统疾病。以铁蛋白＞1 000μg/L定义为铁过载[7]，其中铁过载、非铁过载各100例。铁过载组：男44例，女56 例，年龄 12～84（40.1±16.7）岁；非铁过载组：男 33例，女 67 例，年龄 9～80（37.7±16.2）岁。160 例健康志愿者作为健康对照组，其中男70例，女90例，年龄16～70（40.7±12.3）岁。3组受检者性别、年龄比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

1.2 试剂与仪器 Beckman-Coulter Gen.S LH780全自动血液分析仪、血常规配套试剂、Beckman 5色流式细胞仪、单克隆抗体 CD3+、CD4+、CD8+、CD45+、CD19+、CD16+、CD56+试剂盒、Abbott C1600 全自动生化分析仪及配套试剂购自美国Abbott公司。

1.3 方法

1.3.1 血常规检测 于清晨采集受检者外周静脉血2ml，用乙二胺四乙酸二钾抗凝，使用Beckman-Coulter Gen.S LH780全自动血液分析仪检测，2h内上机完成。获得中性粒细胞数、淋巴细胞数、中性粒细胞/淋巴细胞比值（NRL）。

1.3.2 淋巴细胞亚群（T细胞、Treg细胞、Th细胞、Tc细胞、CD4/CD8、B细胞、NK细胞）检测 血标本6h内染色、上机检测。取流式管，加入10μl不同荧光标记的单克隆抗体，加入外周血100μl混匀，室温下避光放置20min，加入溶血素2ml，室温下放置20min，500g离心6min，弃上清液，加入2ml PBS洗涤，离心，弃上清液，500μl PBS重悬细胞，流式细胞仪检测淋巴细胞亚群表达，包括CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+/CD8+、CD3－CD19+、CD3－CD16+CD56+。

1.3.3 血清铁蛋白检测 采用Abbott C1600全自动生化分析仪检测血清铁蛋白，正常范围14～233ng/ml。

1.4 统计学处理 采用SPSS 18.0统计软件。计量资料用±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐时两两比较采用LSD-t法，方差不齐时两两比较采用Tamhane法。计数资料组间比较采用χ2检验。铁过载和非铁过载组淋巴细胞、NRL、T细胞、NK细胞与铁蛋白之间的相关性分析采用Pearson相关。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组受检者血常规检测结果比较 铁过载组和非铁过载组中性粒细胞数、淋巴细胞数、NRL与健康对照组比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）；铁过载组淋巴细胞数与非铁过载组比较降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；铁过载组NRL与非铁过载组比较升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表 1。

表1 3组受检者血常规检测结果比较

2.2 3组受检者淋巴细胞亚群检测结果比较 铁过载组和非铁过载组T细胞、Treg细胞、Tc细胞、CD4/CD8、NK细胞比例与健康对照组比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）；铁过载组T细胞、NK细胞比例与非铁过载组比较均降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表2。

2.3 铁过载组与非铁过载组患者NK细胞与铁蛋白之间的相关性 铁过载组NK细胞与铁蛋白呈负相关（r=-0.617，P＜0.05），非铁过载组NK细胞与铁蛋白无相关性（r=0.009，P ＞0.05），见图 1、2。

表2 3组受检者淋巴细胞亚群检测结果比较

图1 铁过载组NK细胞与铁蛋白的散点图

图2 非铁过载组NK细胞与铁蛋白的散点图

3 讨论

AA是血液系统的常见疾病，目前认为AA的发病机制主要为造血微环境异常、造血干祖细胞缺陷和免疫异常，这3种机制在不同患者个体中单独或联合作用，最终导致造血功能衰竭[8]。近年来研究发现免疫异常在AA发病中起重要作用，是造成AA造血功能异常的主要原因，T淋巴细胞功能亢进，CD4+与CD8+细胞亚群数量与比值改变，导致免疫功能发生改变，其免疫作用以造血细胞为靶细胞，最终造成全血细胞减少[9]。AA患者长期依赖输血，导致铁沉积，造成机体铁过载，研究发现铁过载可通过升高活性氧（ROS）从而损伤骨髓造血功能，包括直接对造血干细胞[10]以及间接对造血支持间充质细胞[11]的数量和功能损伤。铁过载和机体免疫力的关系近年越来越被重视，免疫因素的介入会加剧铁过载的危害，机体的预后也与铁过载程度相关[12]。本实验以免疫因素作为切入点，分析AA患者和铁过载的免疫联系，初步探讨铁过载对AA患者淋巴细胞亚群的影响。

本研究血常规检测结果发现铁过载组外周血淋巴细胞绝对数降低，中性粒细胞绝对数变化不明显，提示铁过载对淋巴细胞影响较大，于是笔者进一步分析淋巴细胞亚群，结果显示铁过载组与非铁过载组比较，T细胞和NK细胞比例显著降低。研究发现铁既是参与红系造血的重要原料，又作为氧化还原反应的重要催化剂，铁过载使ROS自由基的生产增加[13]，过度的ROS积累可能会导致蛋白和基因氧化损伤，进一步导致细胞的衰老和凋亡[14-15]。有研究显示铁过载通过升高ROS水平，对T淋巴细胞起重要的调节作用，从而影响机体免疫功能[16]。基于以上结果，笔者进一步分析T细胞和NK细胞与铁蛋白的相关性，发现铁过载组NK细胞与铁蛋白呈负相关，提示铁过载对AA患者NK细胞影响较大。NK细胞是一类大颗粒淋巴细胞，通过一系列生物学过程获得激活信号，包括钙内流、细胞骨架重排以及与靶细胞接触部位免疫突触形成等，最终通过分泌细胞因子、趋化因子及释放毒性颗粒执行杀伤和免疫调节功能。Hua等[17]研究骨髓异常增生综合征铁过载与非铁过载患者发现，铁过载组NK细胞内ROS水平升高，主要通过p38和JNK信号通路对NK细胞凋亡进行调控。

综上所述，铁过载对AA患者T淋巴细胞和NK细胞有较大的影响，同时发现铁过载程度与NK细胞具有负相关性，提示铁过载对NK细胞的影响更大，但相关研究目前尚缺乏，笔者将进一步深入研究铁过载对NK细胞的作用机制，为临床治疗AA患者铁过载导致的免疫功能紊乱提供理论客观依据。