蔡炜龙 余胜 汪伟民 楼能

胆囊癌是胆道系统最常见的恶性肿瘤之一[1-2]。由于缺乏早期临床表现，胆囊癌患者确诊时往往已是中晚期，淋巴结转移发生率高，失去根治性手术机会，预后差[3]。因此，寻求新的胆囊癌诊疗靶点尤为重要。miRNA是一类非编码小RNA分子，几乎参与了细胞生命周期的全过程，可作为转录后调节因子调控靶基因的表达[4-6]。目前有研究表明，miR-3662在急性白血病、黑色素瘤及肝癌等恶性肿瘤中异常表达，并在肿瘤的发生、发展过程中发挥着重要作用[7-9]。本研究拟通过检测miR-3662在人胆囊癌组织中的表达水平，并观察其对人胆囊癌细胞增殖能力的影响，从而探讨miR-3662作为胆囊癌新的治疗靶点的可能性，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 主要材料和试剂 30对人胆囊癌组织及其癌旁组织标本源自2015年至2019年本院普外科接受手术治疗、并经术后病理证实为原发性胆囊癌的30例患者；SPF级BALB/c雄性裸鼠8只，4～6周，体重（25.67±3.47）g，购于中国科学院上海动物实验中心。人胆囊癌细胞株GBC-SD和SGC-996由中国科学院上海生命研究院细胞资源中心提供，DMEM培养基和FBS购于美国Gibco公司，miRNA反转录试剂盒和实时荧光定量PCR（qRTPCR）试剂盒购于大连Takara公司，miR-NC和miR-3662购于上海拓然生物科技有限公司，脂质体2000（Lipofectamine 2000）购于美国Invitroen公司，CCK-8试剂盒、结晶紫购于上海碧云天生物科技有限公司。本研究经本院伦理委员会批准。

1.2 实验方法

1.2.1 人胆囊癌组织及其癌旁组织中miR-3662相对表达量检测 采用qRT-PCR法。研磨胆囊癌组织及其癌旁组织，加入Trizol提取组织或细胞的总RNA，检测RNA的浓度和纯度；按miRNA反转录试剂盒说明书将组织 RNA按照 37℃、60min，85℃、5min的程序反转成miRNA，用qRT-PCR试剂盒进行组织样本RNA中miR-3662相对表达量的检测，其相对表达量采用2-△△Ct法计算。

1.2.2 细胞分组、培养及转染 人胆囊癌细胞株GBCSD和SGC-996在含有10%DMEM培养基中培养，放入5%CO2培养箱中37℃恒温培养，取对数生长期细胞进行实验。将细胞分为miR-3662组和miR-NC组，其中miR-3662组细胞转染miR-3662，miR-NC细胞转染miR-NC。分别将GBC-SD和SGC-996铺于6孔板中，24h后根据试剂盒说明书，采用Lipofectamine 2000转染两组细胞，每6孔板内转染50nmol miRNA，转染6h后，更换新鲜培养基继续培养；转染48h后收集细胞进行后续实验。提取细胞RNA后，采用qRT-PCR法检测两组细胞中miR-3662的相对表达量，每次实验重复3次，取平均值。

1.2.3 两组细胞增殖能力检测 采用CCK-8实验。将转染48h后的细胞进行胰酶消化、离心、重悬后计数，将细胞接种于96孔板中，每孔1×103个细胞，每组设置4个复孔，放入5%CO2培养箱中37℃恒温培养。分别于6h、1、2、3、4、5d 加入 20%CCK-8，37℃避光培养 2h 后，使用酶标仪检测450nm处吸光度（A）值来表示细胞增殖能力，并根据A450值绘制细胞生长曲线，上述实验重复3次，取平均值。

1.2.4 平板克隆形成实验 将转染48h后的细胞进行胰酶消化、离心、重悬后计数，将两组细胞分别接种于6孔板中，每孔500个细胞，每组设置3个复孔，放入5%CO2培养箱中37℃恒温培养。持续7d，每3d更换一次培养基。7d后弃培养基，每孔加入1ml 4%多聚甲醛固定后以结晶紫染色。将培养皿放置在倒置显微镜下，观察细胞集落形成数，拍照并采用Image J软件进行计数。

1.2.5 裸鼠皮下移植瘤实验 将8只裸鼠按随机数字表法分为实验组和阴性对照组，每组4只，其中实验组裸鼠接种miR-3662组细胞，阴性对照组裸鼠接种miR-NC组细胞。将转染48h后的细胞进行胰酶消化、离心、重悬后计数，分别配置成浓度为1×107个/ml的细胞悬液，用1ml的注射器沿裸鼠右侧肋弓接种至腋下，之后每周观察裸鼠皮下移植瘤生长情况并进行测量记录。接种4周后，采用颈椎脱位法处死裸鼠。将肿瘤完整剥离下来后，两组裸鼠的肿瘤放在一起进行拍照，将瘤体进行称重，记录并统计。

1.3 统计学处理 采用SPSS 22.0统计软件。计量资料用±s表示，组间比较采用两独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人胆囊癌组织及其癌旁组织中miR-3662相对表达量比较 miR-3662在人胆囊癌组织中的相对表达量0.06±0.02，明显低于癌旁组织的 0.16±0.05，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 两组细胞中miR-3662相对表达量比较 miR-3662组GBC-SD和SGC-996的miR-3662的相对表达量较miR-NC组均明显上调，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表 1。

表1 两组细胞中miR-3662的相对表达量比较

2.3 两组细胞增殖能力比较 加入CCK-8后第5天时，与miR-NC组相比，miR-3662组细胞A450值明显为小，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。

2.4 两组细胞集落形成数比较 miR-3662组GBC-SD和SGC-996的集落形成数较miR-NC组均明显减少，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图2（插页）、表2。

图1 两组细胞A450值比较（与miR-NC组比较，*P＜0.05）

表2 两组集落形成数比较（个）

2.5 两组细胞移植瘤质量比较 实验组裸鼠皮下移植瘤质量（0.057±0.012）g，较阴性对照组（0.210±0.042）g明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3。

图3 两组移植瘤体积比较

3 讨论

近年来，胆囊癌的发病率逐年升高，中位生存时间仅有不到20个月，预后极差[10-11]。尽管目前胆囊癌在化学治疗、靶向治疗和免疫治疗等药物研究上有所突破，但由于肿瘤耐药性等原因，治疗效果仍较差。因此，迫切需要新的胆囊癌分子靶点应用于临床。目前已有超过1 400多条miRNA被发现在恶性肿瘤的发生、发展中发挥重要的生物学功能，可通过类似癌基因、抑癌基因或其他方式调控肿瘤细胞的增殖、凋亡和迁移等活动[12-13]。miRNA在胆囊癌中也发挥着重要作用，研究表明，大量miRNA 如 miR-29c-5p、miR-143-3p、miR-139-5p 等在胆囊癌中差异表达，调控胆囊癌的发生、发展[14-16]。miR-3662在多种恶性肿瘤中表达失调，Powrózek等[17]比较了90例肺癌患者的血浆样本与85例健康对照组的血浆样本，发现miR-3662在肺癌患者中的表达明显上调，有望成为潜在的肺癌生物标志物。Maharry等[18]报道发现miR-3662的表达丰度越高，造血组细胞（尤其是红系谱系）中的集落形成数越多，而急性髓样白血病细胞中并无miR-3662的表达，且miR-3662过表达具有抗白血病的作用。Chen等[9]发现miR-3662在肝癌细胞中表达下调，通过作用于下游靶基因HIF-1α调控瓦博格效应和肝癌的进展。这些结果均表明miR-3662可能成为新的恶性肿瘤标志物和药物靶点。

本研究笔者检测了30对胆囊癌组织和癌旁组织中miR-3662的相对表达量，发现相比于癌旁组织，miR-3662在胆囊癌组织中的相对表达量明显下调。在胆囊癌细胞中转染miR-3662后，qRT-PCR显示GBC-SD和SGC-996细胞中miR-3662的相对表达量明显上调。通过CCK-8细胞增殖实验和平板克隆形成实验发现，过表达miR-3662后GBC-SD和SGC-996细胞的体外增殖能力明显下调。裸鼠皮下移植瘤实验结果显示miR-3662过表达后移植瘤体积明显缩小，且质量更小，提示miR-3662可在体内抑制胆囊癌细胞的增殖能力。本研究表明，miR-3662可能作为抑癌miRNA在胆囊癌中发挥生物学功能，体内外实验均表明miR-3662可以抑制胆囊癌细胞的增殖能力，提示其可为胆囊癌的新的分子靶点，但其下游调控的分子及信号通路仍有待进一步研究。