陈志文 胡晓伟 樊胜杰

1湖北省襄阳市中西医结合医院普外科，襄阳 441004；2湖北省谷城县人民医院普外科，谷城 441700

近年来随着测序技术和相关领域基因学的迅速发展，长链非编码RNA(long noncoding RNA, lncRNA)的生物学功能逐渐受到重视。研究表明lncRNA 在生物体内生物学功能广泛，尤其在基因转录后、细胞周期和分化等多个层面调控基因的表达[1]。lncRNA肿瘤易感性候选基因9 (cancer susceptibility candidate 9，CASC9)在食管鳞癌和肝癌中的表达明显升高，发挥着重要的促癌作用[2-3]。微小RNA-195-5p(miR-195-5p)是一类抑癌基因，生物信息数据库检索发现miR-195-5p是CASC9下游靶点之一[4]，在骨肉瘤、肝癌、舌鳞癌等癌细胞中呈低表达状态[5-6]。但目前有关 CASC9与miR-195-5p在胰腺癌中的作用机制尚不清楚。本研究检测 CASC9在胰腺癌组织和细胞中的表达水平，分析 CASC9及其靶基因miR-195-5p对胰腺癌BxPC-3细胞增殖和凋亡的作用，以期为胰腺癌治疗提供新的理论依据。

资料与方法

一、胰腺癌组织、细胞株CASC9和miR-195-5p表达检测及两者相关性分析

选取2017年4月至2018年5月间湖北省襄阳市中西医结合医院行手术切除并经组织病理学证实的40例胰腺癌患者的癌组织及相应癌旁正常胰腺组织(距离手术切缘>3 cm)。术前患者均未接受化疗、放疗等辅助治疗。所有标本取下后立即放入-196℃液氮中保存。

应用Trizol法抽提胰腺癌组织及癌旁组织总RNA，RNA逆转录与扩增按试剂盒(日本TaKaRa公司)说明书操作，转录的cDNA再用GreenTMTB Premix Ex TaqTM(TliRnaseH Plus，日本TaKaRa公司)行实时荧光定量PCR反应。 CASC9正向引物序列5′-AGATGAAGCCGGTACCTCAGAT-3′，反向引物序列5′-TCACTTTAAAGAGGGAGAGGAG-3′；内参GAPDH正向引物序列5′-TATGATGATATCAAGAGGGTAGT-3′，反向引物序列5′-TGTATCCAAACTCATTGTCATAC-3′；U6正向引物序列5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物序列5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。通过仪器自带软件获取扩增产物的Ct值，采用公式2-ΔΔCt计算各基因相对表达量，每个样品设3个复管，取均值。

正常胰腺导管上皮细胞株HPDE6-C7及胰腺癌细胞株AsPC-1、HPAC、BxPC-3、PANC1均由中国科学院细胞库提供，常规复苏、传代。取对数生长期细胞，采用上述相同方法检测细胞CASC9表达量。

采用上述方法检测20例胰腺癌组织miR-195-5p表达量。miR-195-5p正向引物序列5′-GATAGCAGCACAGAAATATTGGC-3′，反向引物序列5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′。分析胰腺癌组织miR-195-5p与CASC9表达水平的相关性。

二、胰腺癌BxPC-3细胞分组及检测

1．BxPC-3细胞分组：将BxPC-3细胞分为si-CASC9组(转染靶向lncRNA CASC9的siRNA)、si-control组(转染与CASC9不匹配的siRNA)、CACS9组(转染CASC9过表达质粒)和CASC9/miR-195-5p组(共转染CASC9过表达质粒和miR-195-5p mimics)。所有siRNA、质粒及miR-195-5p mimics均由上海Gene Pharma公司设计、合成。使用脂质体2000试剂(Thermo Fisher Science，美国)进行细胞转染，按照说明书操作。运用Geneticin(Sigma-Aldrich,美国)筛选出稳定转染的细胞株。

2．BxPC-3细胞增殖活性检测：选用3～6代si-control组、si-CASC9组、CACS9组、CASC9/miR-195-5p组BxPC-3细胞，以每孔1×104个细胞均匀接种于96孔板，分别培养1、2、3、4 d，到时间点时每孔加入5 mg/ml MTT(武汉博士德生物科技有限公司)20 μl，继续孵育4 h，每孔再加入150 μl DMSO，室温摇床振荡10 min，上酶标仪在490 nm处测定每孔的吸光度值(A490值)，绘制细胞生长曲线。

3．BxPC-3细胞凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2检测：收集si-control组、si-CASC9组、CACS9组、CASC9/miR-195-5p组BxPC-3细胞，加入蛋白裂解液(Roche,美国)抽提总蛋白，应用BCA法定量后常规行蛋白质免疫印迹法检测Bax和Bcl-2蛋白表达，以GAPDH为内参。抗Bax抗体(ab32503，1∶1 000)和抗Bcl抗体(ab32124,1∶1 000)均购自英国Abcam公司，HRP二抗(1∶3 000)购自武汉博士德生物科技有限公司。最后ECL发光，X片曝光、显影、定影。用Image J软件分析，以目的条带与内参条带的灰度值比表示蛋白相对表达量。

三、lncRNA CASC9与miR-195-5p的关系验证

从Starbase数据库(http://starbase.sysu.edu.cn/)搜索CASC9的潜在靶向基因，通过荧光素酶报告基因法验证lncRNA CASC9和miR-195-5p之间的靶向关系。将扩增的野生型(wild type, WT)lncRNA CASC9序列插入pmirGLO dual-luciferase miRNA target expression vector (Promega Corp，美国)，构建WT荧光报告载体pmirGLO-WT-CASC9。使用GeneArtTMSite-Directed Mutagenesis PLUS System(A14604, Thermo Fisher Scientific Inc.美国)推定突变lncRNA CASC9与miR-195-5p的结合位点，将突变体(mutant type, MT)lncRNA CASC9片段插入pmirGLO载体，构建MT荧光报告载体pmirGLO-MT-CASC9。将2个报告载体分别和miR-195-5p mimics或阴性对照mimics(mimics-NC)共转染BxPC-3细胞(分别设为WT-CASC9/miR-195-5p组、MT-CASC9/miR-195-5p组和WT-CASC9/mimics-NC组、MT-CASC9/mimics-NC组)，48 h后按照试剂盒说明书测定荧光素酶活性。实验重复3次。

四、统计学处理

结 果

一、胰腺癌组织和各细胞株lncRNA CASC9表达量

胰腺癌组织及其癌旁正常胰腺组织lncRNA CASC9表达量分别为4.70±1.25、2.15±0.82，癌组织显著高于癌旁正常组织，差异有统计学意义(t= 2.95，P=0.04)。HPDE6-C7、AsPC-1、HPAC、BxPC-3、PANC1细胞株中lncRNA CASC9表达量分别为1.00±0.10、1.43±0.12、1.86±0.13、2.03±0.14、1.73±0.15，胰腺癌细胞株均显著高于HPDE6-C7细胞，差异均有统计学意义(t值分别为4.77、9.08、10.37、7.01，P值均<0.001)。其中以BxPC-3细胞CASC9的表达量最高，故实验均采用BxPC-3细胞。

二、抑制BxPC-3细胞lncRNA CASC9表达可抑制细胞增殖，促进细胞凋亡

si-CASC9组lncRNA CASC9表达水平显著低于si-control组(0.26±0.026比1.00±0.06，t=19.56，P< 0.001)，表明抑制lncRNA CASC9表达的BxPC-3细胞株构建成功。

si-control组和si-CASC9组细胞的生长曲线见图1A。培养第3、4天的si-CASC9组细胞较si-control组细胞的增殖活性显著下降(0.57±0.05比0.72±0.04，t=4.05，P=0.01；0.75±0.07比0.95±0.07，t=3.49，P=0.02)，差异有统计学意义，提示抑制lncRNA CASC9表达可抑制BxPC-3细胞增殖。si-control组、si-CASC9组Bax 表达水平分别为1.07±0.11、1.39±0.13，Bcl-2表达水平分别为1.71±0.12、1.44±0.11，表明抑制lncRNA CASC9表达可显著上调Bax(t=3.26，P=0.03)、下调Bcl-2表达水平(t=2.85，P=0.04)，提示抑制lncRNA CASC9表达可促进BxPC-3细胞凋亡(图1B)。

三、lncRNA CASC9与miR-195-5p的靶向关系确定

来自Starbase数据库下载图所示，CASC9包含miR-195-5p的保守目标位点(图2A)。20例胰腺癌组织lncRNA CASC9和miR-195-5p表达量见图2B，计算出lncRNA CASC9和miR-195-5p之间的相关性系数R2=0.549，证实lncRNA CASC9与miR-195-5p表达之间存在负向调节的关系。双荧光素酶报告法检测结果显示，WT-CASC9/miR-195-5p组、WT-CASC9/mimics-NC组、MT-CASC9/miR-195-5p组、MT-CASC9/mimics-NC组的荧光素酶活性分别为0.37±0.03、1.00±0.08、0.96±0.06、1.00±0.08，WT-CASC9/miR-195-5p组较MT-CASC9/miR-195-5p组显著下降(t=12.77，P<0.001)，而WT-CASC9/mimics-NC组与MT-CASC9/mimics-NC组间的差异无统计学意义(t=0.75，P=0.49)，证实lncRNA CASC9和miR-195-5p之间可以靶向结合。

四、miR-195-5p逆转CASC9促进胰腺癌细胞增殖和抑制细胞凋亡的作用

CASC9/miR-195-5p组中miR-195-5p mimics转染对BxPC-3细胞CASC9的表达无显著影响(2.45比2.33，t=1.44，P>0.05)，只是增加了细胞miR-195-5p的表达(0.37比0.88，t=13.97，P<0.001)。MTT实验结果显示，第2、3、4天时si-control组A490值分别为0.26±0.02、0.37±0.02、0.40±0.02，CASC9组分别为0.34±0.02、0.57±0.03、0.71±0.03，CASC9/miR-195-5p组分别为0.29±0.02、0.45±0.02、0.59±0.03。CASC9组细胞增殖活性较si-control组显著增加(t=4.90、9.61、14.89，P值均<0.05)，而CASC9/miR-195-5p组细胞增殖活性较CASC9组显著下降(t=3.06、5.77、4.90，P值均<0.05)，提示lncRNA CASC9促进BxPC-3胰腺癌细胞增殖的作用被miR-195-5p逆转。蛋白质免疫印迹法结果显示， CASC9组Bax表达水平显著低于CASC9/miR-195-5p组(0.56±0.03比0.68±0.04，t=4.16，P=0.01)，Bcl-2表达显著高于CASC9/miR-195-5p组(1.47±0.04比1.05±0.03，t=14.55，P<0.001(图3)，提示lncRNA CASC9抑制BxPC-3细胞凋亡的作用被miR-195-5p逆转。

图1 si-control组和si-CASC9组BxPC-3细胞的生长曲线(1A)及Bax(1)和Bcl-2(2)蛋白的表达(1B)

图2 CASC9与miR-195-5p结合位点(2A)及胰腺癌组织CASC9与miR-195-5p表达关系(2B)

图3 si-control组(1)、CASC9组(2)、CASC9/miR-195-5p组(3)BxPC-3细胞及Bax、Bcl-2蛋白表达

研究显示非编码RNA在肿瘤的发生和发展中扮演着重要的角色[7-9]，其中lncRNAs生物学功能包括参与表观遗传调控、转录调控、转录后调控、miRNA调控、细胞分化及发育，其重要机制之一是通过对周围的相关编码基因的选择性表达发挥调控作用[10]。例如lncRNA CASC9在食管癌中的表达明显升高，抑制其表达能抑制食管癌细胞的发生和发展[11]。此外，有研究表明lncRNA CASC9可显著抑制鼻咽癌和肝癌的恶性表型[2-13]。这些研究提示可通过在表达水平上具有显著性差异的lncRNA来寻找包括胰腺癌在内的多种疾病诊断及治疗的分子标志物。本研究首次证明胰腺癌组织和细胞系lncRNA CASC9表达显著上调，抑制其表达能抑制胰腺癌细胞增殖，促进胰腺癌细胞凋亡，提示CASC9是一种促癌的lncRNA，在胰腺癌进展中起着关键作用。

miRNAs是内源性的小非编码RNA，但与功能基因的表达密切相关[14]。miR-195-5p在许多肿瘤中表达下调，比如舌鳞状细胞癌[15]和膀胱肿瘤[16]，目前被认为是一个抑癌的miRNA。最近研究发现lncRNAs通过作为miRNAs的竞争性内源RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)发挥作用。有研究表明，下调miR-196-5p的表达可促进原发性腹膜癌的肿瘤进展和维持肿瘤干细胞特征[17]。也有研究表明，miR-195-5p通过靶向子宫内膜癌中lncRNA PVT1发挥促癌作用[23]。受ceRNA调节网络的启发，本课题组假设lncRNA CASC9也可能是一种ceRNA。通过生物学信息和双荧光素酶分析证实lncRNA CASC9能特异性结合miR-195-5p，功能性实验表明CASC9与miR-195-5p的表达呈负相关，且miR-195-5p能逆转CASC9促进胰腺癌恶性表型的效应，从而证明了CASC9可能作为胰腺癌细胞miR-195-5p的竞争性内源RNA发挥作用。

综上所述，本研究通过临床样本和体外细胞实验证实，miR-195-5p通过靶向结合lncRNA CASC9可逆转CASC9促胰腺癌细胞增殖和抑制胰腺癌细胞凋亡的作用。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突