王 轩,程为平,程光宇△

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040； 2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

癫痫是由多种原因引起的脑部慢性疾患，产生癫痫发作的持续性脑部改变及脑区高度异常同步化放电是其特征[1]。虽然抗癫痫药仍是目前治疗癫痫的主要手段，但因抗癫痫药物的毒副作用或外科手术的禁忌症等局限，需要寻找其他能辅助或替代治疗癫痫的其他手段。电针是在针刺的基础上加上电疗法，具有保持针感、调整刺激量与强化针刺的作用[2]。本研究通过研究电针百会、腰奇穴对戊四氮致痫大鼠脑电信号的影响，分析波幅、频率和功率谱密度的改变，探讨电针治疗戊四氮致痫大鼠的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

30只SD雌性大鼠均来自黑龙江中医药大学动物实验中心，体质量250～280 g，温度(22±3)℃、12 h明暗循环的饲养环境中，给予自由饮食和饮水。适应性喂养1周后进行耳标标记，用计算机生成的随机数表随机选取10只作为空白组，余20只用于癫痫点燃。所有实验内容经黑龙江中医药大学动物伦理委员会同意。

1.2 仪器和试剂

戊巴比妥钠 (1507002-200MG)；16通道生理信号记录仪(MP150，美国BIOPAC公司);脑立体定位仪(68001，深圳市瑞沃德生命科技有限公司);颅骨钻(LGZ-1,南京卡尔文生物科技有限公司);电极配件(MS363，E363/20/2.4/SP,美国Plastics One Inc.);30%双氧水，义齿基托聚合物(Ⅱ型Ⅰ类,上海贝琼齿材有限公司);义齿基托树脂(Ⅱ型Ⅰ类,上海新世纪齿科材料有限公司)。

1.3 电极植入

所有大鼠经戊巴比妥钠腹腔麻醉(50 mg/kg)后剥开头皮清除骨膜露出头骨，以前囟为参照点，参考Paxinos & Watson编著的《大鼠脑图谱》[3]。在左右海马 (AP：-3.9 mm，ML或MR:2.6 mm) 立体定位钻孔，植入电极E363后连接MS363基座，用义齿基托材料固定。

1.4 模型建立与癫痫发作行为学评估

术后恢复7 d后连接MP150打开AcqKnowledge软件记录基线1 h后进行戊四氮造模。

1.4.1 模型建立 每天上午9：00腹腔注射亚剂量的PTZ35 mg/kg。观察大鼠的行为学变化并记录脑电1 h。

1.4.2 癫痫发作情况 根据Ravine分级标准[4]：1级，面部抽动，咀嚼明显；2级，点头；3级，单侧前肢阵挛抬起；4级，双侧前肢阵挛抬起和站立；5级，双侧前肢阵挛，站立以及失去平衡跌倒进行评价。1～3级为局灶性发作，4～5级为全身性发作 (大发作)。当动物连续至少3次惊厥程度不低于4级且EEG有癫痫样波出现时视为造模成功，7 d后用于电针治疗实验。在造模过程中，如大鼠持续性大发作不止时,当给予10%的水合氯醛(5 mg/kg)抢救。空白组在相同的时间给予同等剂量的生理盐水腹腔注射。造模成功的20只大鼠依据耳标数字再依据计算机随机数字表法分成模型组、电针组。

1.5 干预措施

1.5.1 空白组和模型组 每日早09：00用自制保定器固定大鼠，连接脑电记录数据10 min，拆除保定装置，继续记录脑电图2 h。

1.5.2 电针干预 ①取穴：依据《实验针灸学》[5]中“常用的大鼠针灸穴位及图谱”进行大鼠穴位的定位及针刺深度。百会穴：大鼠头顶两耳根连线与前后中线交点。腰奇穴: 大鼠背部正中腰骶部，第 4腰椎与第1尾椎之间的凹陷中。②针具与仪器：华佗牌毫针，规格0.18 mm×13 mm；SDZ-Ⅱ型华佗牌电针治疗仪。③操作：每日早09：00用自制保定器固定大鼠，暴露四肢。连接脑电记录数据。消毒施术部位。将毫针于百会穴向后平刺0.9 mm；腰奇穴向前平刺13 mm；将SDZ-Ⅱ型华佗牌电针治疗仪的正极、负极导线分别连接百会穴、腰奇穴针柄上。给予的电针刺激参数[5]为100 Hz，强度以动物能耐受并保持安静为度，时间为10 min。电针结束后拆除电针治疗仪及保定装置继续记录脑电图2 h。1次/d，共计14 d。

1.6 观测指标

本实验按照不同阶段脑电信号特征对正常组→正常时、模型组→癫痫发作时和电针组→电针治疗时和电针治疗后信号截取并施行时域分析，傅里叶变换后进行频域分析。即提取正常时、癫痫发作时、电针治疗时、电针治疗后4个状态的脑电波信号强度并对其对比分析。

1.7 信号处理与统计分析

MP150获取的脑电信号以200 Hz采样率进行采样，通带频率0.1～100 Hz。滤波50 Hz 。以 10 s 为单位进行信号拼接观察脑电信号的时域，频域变化趋势。计量资料使用均数±标准差(mean±SD)表示，计数资料使用百分数表示，等级资料使用秩均值表示。对满足正态性、方差齐性和独立性的数据采用单因素方差分析(One-way ANOVA)进行相关分析，否则采用非参数检验，以P<0.05代表差异有统计学意义，P<0.01代表差异有显著统计学意义。

2 结果

2.1 电针对戊四氮致痫大鼠脑电信号的时域分析结果

如表1、图1～2分别显示4个状态下(正常时、发作时、电针时、电针后)戊四氮致痫大鼠脑电图和时域指标结果。研究发现，正常大鼠脑电波平均波幅在7.61 mV，癫痫发作时平均波幅升高到53.2 mV左右，电针治疗时、电针治疗后波幅分别为46.48 mV、20.06 mV。与正常时对比，其他状态下脑电图波幅局升高(P<0.01)，与发作时对比电针时、电针后脑电图波幅下降(P<0.01)，电针后波幅较电针时波幅下降明显(P<0.01)。

表1 不同状态下脑电信号波幅LSD法事后比较结果

注：基于估算边际平均值，*平均值差值的显著性水平。a多重比较调节：最低显著差异法(相当于不进行调整)。

图1 不同状态下的脑电图

图2 不同状态下的波幅(mV)折线轮廓图

2.2 电针对戊四氮致痫大鼠脑电信号的频域分析结果

将图1中4种状态下的脑电信号进行傅里叶变换并进行频域分析，对表2、图3的4个状态下脑电信号频率分析发现；原始脑电信号中，正常大鼠平均频段范围(11.47±5.08)，发作时频段范围(22.88±18.5)，数值升高范围增加，与正常对比差异有统计学意义(P<0.01)，电针治疗时和治疗后频段范围(49.61±0.00、41.74±15.65)，与正常时比较数值升高范围集中(P<0.01)；与发作时比较数值同样升高范围集中明显(P<0.01)。电针治疗前后比较，电针后频段数值降低范围略有增宽(P<0.01)。将原始脑电信号进行滤波后发现Delta、Theta、Alpha、Beta、Gamma共5个频段的脑电信号主频率集中趋势有所变化。Delta波段电针后主频率波段与正常时和发作时比较范围缩小(P<0.01)。Theta波段发作时与正常时对比，主频率数值降低，波动范围略增大，电针前后与发作时比较主频率数值增大、范围略缩小，差异均有显著统计学意义(P<0.01)。Alpha电针后与正常时、发作时比较主频率均略增大(P<0.05或P<0.01)。Beta、Gamma频段发作时与正常状态对比主频率数值降低，范围变化不明显(P<0.01)。电针时与正常时和发作时比较主频率数值升高明显，集中在49.61 Hz(P<0.01)，提示电针时Beta、Gamma高度协同耦合。电针后Beta频段主频率与正常时数值变化不明显(P>0.05)，与发作时对比仍略有增高(P<0.05)，与电针时对比数值降低明显(P<0.01)，电针后Gamma频段与电针时比较差异无统计学意义，主频率数值仍集中在49.61 Hz，与正常时、发作时比较均增高(P<0.01)。

Peak FnRawDeltaThetaAlphaBetaGamma正常1011.47±5.085.14±0.646.69±1.0310.38±2.0618.21±3.3937.00±11.62发作时1022.88±18.5△△5.11±0.956.59±1.2△△10.29±2.2717.72±4.07△△34.09±11.71△△电针时1049.61±0△△▲▲5.16±0.646.64±0.92▲▲10.4±2.0649.61±0△△▲▲49.61±0△△▲▲电针后41.74±15.65△△▲▲☆5.12±0.55△△▲▲6.66±1.1▲▲10.79±2.29△▲▲18.38±3.49▲☆☆49.61±0△△▲▲

注：不同状态间比较采用LSD法;与正常状态比较,△P<0.05,△△P<0.01;与发作时比较,▲P<0.05,▲▲P<0.01;与电针时比较,☆P<0.05,☆☆P<0.01。

图3 不同状态下的原始脑电信号频率(Hz)

2.3 电针对戊四氮致痫大鼠脑电信号的功率谱密度(PSD)分析结果

对如图4～5所示的4种状态下脑电信号进行功率谱密度(PSD)研究发现，不同状态下脑电信号能量值不同、集中频段不同；正常大鼠能量主要集中在低频区域，随着频段的增加能量减少，50 Hz左右处存在高度能量值；发作时各频段范围的能量均有增加，频谱能量主要集中在25 Hz左右，50 Hz处变平坦；电针时Delta、Theta、Alpha、Beta、Gamma频段均有波动，Gamma频段的能量高度集中，突出于其他状态；电针后各频段能量均有所降低，波动趋势接近正常大鼠。图4中大于50 Hz时原始脑电信号PSD趋势较平坦。

图4 不同状态下的功率谱密度(mV2/Hz)

图5 不同状态下不同频段的功率谱密度直方图

2.4 电针对戊四氮致痫大鼠各频段脑电信号的功率谱密度(PSD)分析结果

将图1中原始脑电信号进行滤波，分析Delta、Theta、Alpha、Beta、Gamma共5个频段在Total PSD所占的比重与趋势。如表3、图6所示不同状态下各频段脑电信号的功率谱密度关系，正常大鼠脑电信号能量主要集中在Delta频段，发作时Delta、Theta、Gamma频段能量比例降低，Alpha、Beta频段能量比重升高，其中Beta频段、Gamma频段能量比重变化最大。电针时Delta、Theta、Alpha、Beta各频段能量比重均降低，Gamma频段能量占68.18%，结合2.2中电针时Beta、Gamma主频率高度协同集中在49.61 Hz猜测，Gamma频段可能与电针的治疗作用相关。电针后各频段能量比重接近正常大鼠，Gamma频段能量比重基本回归。

表3 不同状态下不同频段的功率谱密度(mV2/Hz)比例

注：从图1中过滤出频段Delta：0.3～4 Hz，Theta：4～8 Hz，Alpha:8～13 Hz，Beta:13～30 Hz，Gamma：30～80 Hz，分别计算各频段能量密度占总能量密度的比例。

图6 不同状态下各频段脑电信号的功率谱密度箱型图

3 讨论

癫痫病属于中医学的“痫症”范畴。针灸治疗从先秦的《黄帝内经》到清朝《针灸集成》共有62本著作， 156条文献， 128个穴位记载[6]。由于癫痫病位在脑，脑为髓海，督脉上行入脑，督脉为阳脉之海，其空虚则不能上荣充脑，造成髓海不足。“督脉腰脊强痛，大人癫病，小人风痫疾。” 可见邪犯督脉、经气受阻、清阳不升, 会导致癫痫发病。督脉作为治疗癫疾的首选经脉，百会穴是督脉与手足三阳经的交会穴，是治疗癫痫的重要穴位，具有开窍醒脑、回阳固脱的作用，其可通督定痫、安神定志。腰奇穴是督脉上的经外奇穴，亦是治疗癫痫的要穴。二者上下相配为用，振奋阳气、疏调督脉、上下贯通、脑髓得充、抵御外邪，治疗癫痫。在对针刺百会、腰奇穴的抗癫痫机制研究中，柳成刚等[7]发现二穴相配治疗PTZ致痫大鼠可使血清IL-1β表达降低、血清IL-6表达升高、BAX的表达降低、海马神经元的损伤减轻。姜元辉等[8]发现癫痫大鼠惊厥潜伏期延长、海马区NO含量增加、NOS和SOD活力上升。

脑电图研究方面，昂文平等[9]发现针刺百会、风池穴时癫痫大鼠的发作潜伏期延长，癫痫波的持续时间缩短，癫痫发作频率降低。王津存等[10]认为电针刺激百会穴有明显的抑痫作用，可使致痫大鼠慢性期自发性癫痫发作次数减少，脑电图癫痫波放电次数降低，其电生理机制与百会穴的神经节段性分区有关，认为百会穴同时位于三叉神经和枕大神经分布区域，电刺激后神经冲动传入三叉神经感觉核再投射到各个脑区中枢整合后产生抑痫信号纠正了异常放电。与此理论相似的研究认为刺激穴位产生的兴奋信息形成神经冲动，由躯干神经传入迷走神经分支传出协调自主神经张力，调节脑区平衡，达到治疗癫痫发作的效果[11-12]。除此之外，针灸治疗癫痫的研究还集中在神经递质(NO、5-HT、多巴胺、肾上腺素等)、细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α等)、第二信使(Ca-CaM)和细胞信号转导通路等方面[13-14]，认为针刺可以通过以上途径调控相关基因表达水平达到治疗癫痫的目的。

本实验通过电针百会、腰奇穴对戊四氮致痫大鼠4种状态下脑电信号分析后发现，正常大鼠能量主要集中在Delta频段(38.54%)、Theta频段(23.24%)，Gamma频段比例最低(4.47%)。癫痫发作时常见的癫痫波为棘波、尖波、棘慢波、尖慢波等[15]，棘波的频段范围14～50 Hz，尖波的频段范围5～14 Hz，棘慢复合波、尖慢复合波的频段范围在2～5 Hz。本研究中癫痫发作时波幅从7.61 mV升高到53.2 mV，频率变化集中在Beta频段和Gamma频段，前者主频率数值降低集中在(17.72±4.07)Hz，后者主频率升高集中在(34.09±11.71)Hz， Alpha频段、Beta频段的功率谱密度能量比重显著增加，Gamma频段比重降低明显。提示戊四氮致痫大鼠癫痫发作时癫痫波主要表现为棘波，PTZ致痫大鼠癫痫发作时波幅升高，各频段主频率数值或增高或降低，能量比重失调，去趋势明显。电针治疗时、治疗后脑电信号波幅降低向正常状态回归，电针时频段改变主要集中在Beta频段和Gamma频段，二者高度拟合，主频率均集中在49.61 Hz。电针后Beta频段主频率基本回归到正常水平，Gamma频段主频率仍集中在49.61 Hz。结果表明，电针百会、腰奇穴对戊四氮致痫大鼠的脑电信号影响主要集中在Beta频段、Gamma频段。现代研究认为新皮质的电活动可通过內嗅皮质传入海马，在此经过整合后，输出到边缘系统其他结构、大脑皮质及脑干下行通路[15]。海马的特殊环路结构使之具有“放大器”的效应，微小异常的电活动在此环路内被逐渐放大，经传出通路抵达效应器后引起脑电活动的异常同步化，因而海马常常为癫痫发作的起源地。神经元具有频率共振特性，海马椎体细胞的胞体、丘脑皮质神经元等在θ频段有很好的共振特性，抑制性中间神经元在Gamma频段有更好的共振性[15]。海马抑制性中间神经以GABA能神经元为主，因此推测GABA能神经元与Gamma频段相关。GABA能神经元是海马中主要的抑制性中间神经元，GABA能神经元在海马神经环路中起着节律发生器的作用，其分泌的γ-氨基丁酸是拮抗谷氨酸兴奋性的主要神经递质，GABA能神经元兴奋γ-氨基丁酸分泌增多，GABA/GLU比值增加拮抗癫痫发作。有研究指出抗癫痫药物和镇静催眠类药物(巴比妥类、苯二氮卓类)可以引起Beta频段的主频率增加，这可能与药物和GABAA受体结合促进活性、增强中枢抑制有关。

综上，通过对电针百会、腰奇穴对戊四氮致痫大鼠脑电信号的影响分析后得出，电针百会、腰奇穴可以降低戊四氮致痫大鼠脑电信号波幅，提高Beta频段和Gamma频段的主频率，协调各频段的能量，使各指标回归到正常状态；其抗癫痫作用与GABA 中间抑制性神经元产生的兴奋性电活动相关。