扳倒井酒用微生物的分离鉴定及功能性、抗逆性研究

2020-06-17董乔娟于文娟姜明慧于盼盼杨庆振白秀彬赵纪文

酿酒科技 2020年5期

董乔娟，于文娟，许玲，姜明慧，于盼盼，杨庆振，白秀彬，赵纪文

（山东扳倒井股份有限公司，山东高青 256300）

传统大曲生产与白酒酿造为开放性的固态发酵方式，从而形成了“多微共酵”的发酵体系，是影响白酒风格和品质的重要基础。对于白酒酿造微生物的研究，多集中于功能微生物的分离、筛选、鉴定及应用。在白酒酿造中大量宝贵的微生物资源，对后期应用生产实验，稳定并提高白酒的风格和品质提供基础与保障[1-2]。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

1.1.1 供试材料

扳倒井高温大曲、扳倒井发酵酒醅、扳倒井窖泥。

1.1.2 培养基

细菌分离培养基：营养琼脂；酵母菌、霉菌分离培养基：孟加拉红培养基；细菌保藏培养基：同细菌分离培养基；酵母菌保藏培养基：麦芽汁琼脂培养基；霉菌保存培养基：察氏培养基；细菌种子培养基：葡萄糖1%，牛肉膏1%，氯化钠0.5%；酵母菌种子培养基：玉米糖化液；麸皮固体培养基；细菌液体培养基：同细菌种子培养基；酵母菌液体培养基：麦芽浸粉肉汤；霉菌液体培养基：蛋白胨1%，葡萄糖1%，磷酸氢二钾0.1%，七水硫酸镁0.05%。

1.1.3 仪器设备

HIRAYAMA HVE-50 立式自动灭菌器、ESCO CLASSII BSC AC2-6S1 生物安全柜、Bio-Cinerator红外接种环灭菌器、QL-901 振荡器、江苏太仓DHZ-CA大容量振荡器、上海一恒GPH-9160"隔水式恒温培养箱、上海卉绿DHG-9145A 电热恒温鼓风干燥箱、上海博迅HHS-21-8 数显恒温水浴锅、普析通用T6 新世纪紫外可见分光光度计、OLYMPUSCX41 光学显微镜、德国Eppendorf 5424R 型高速冷冻离心机、德国Biometra Tone 96 型台式PCR扩增仪、君意东方JY330C 琼脂糖凝胶电泳仪、君意东方JY04S-3C凝胶成像分析系统等。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种的分离、纯化

微生物的分离培养采用稀释平板涂布法。准确称取25 g 样品，置入装有225 mL 无菌生理盐水和玻璃珠的三角瓶中，振荡10 min，放入30 ℃培养箱中静置30 min。

用移液枪吸取1 mL 震荡均匀的菌悬液，置入装有9 mL 无菌水的试管中，振荡均匀，进行系列稀释，依次稀释到10-6。选取10-3、10-4、10-5、10-64 个稀释梯度分别在营养琼脂和孟加拉红平板上进行涂布，营养琼脂平板于37 ℃下倒置培养24 h；孟加拉红平板于28 ℃下倒置培养2～3 d。

培养结束后，挑取平板上生长出的单菌落，继续进行多次划线等纯培养操作，直至平板上菌落形态单一为止。编号，接种于斜面试管中保藏[3]。

1.2.2 菌株的形态特征观察

宏观形态观察：将细菌接种到营养琼脂培养基上，35 ℃恒温培养2 d，观察菌落特征；将酵母菌接种到麦芽汁琼脂培养基上，28 ℃恒温培养2～3 d，观察菌落特征；将霉菌接种到察氏培养基上，28 ℃恒温培养5～7 d，观察菌落特征。

微观形态观察：将细菌接种到营养琼脂培养基上，35 ℃恒温培养2 d，用接种环挑取少许菌落，制成水浸片，置于10×100 倍油镜下进行观察；将酵母菌接种到麦芽汁琼脂培养基上，28 ℃恒温培养2～3 d，用接种环挑取少许菌落，制成水浸片，置于10×40 倍显微镜下进行观察；将霉菌接种到察氏培养基上，28 ℃恒温培养5～7 d，取1 滴棉兰染色液置于载玻片中央，用透明胶带在菌落边缘粘取少量菌体，覆于染色液上，置于10×40 倍显微镜下进行观察。

1.2.3 菌株的分子生物学鉴定

DNA 的提取使用天根基因组DNA 提取试剂盒。细菌采用16S rDNA 分子生物学鉴定，引物设计为27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'；酵母菌采用ITS 分子生物学鉴定，引物设计为ITS5:5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3' 和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'；霉菌采用BT 分子生物学鉴定，引物设计为Bt2a：5'-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3'和Bt2b：5'-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3'。利用PCR 扩增技术分别对16S rDNA、ITS 和BT 进行扩增后送样测序，测序工作由上海生工完成。

1.2.4 菌株的冻干管制备及入库保藏

以脱脂牛奶为保护剂，将筛选得到的高酶活菌株和抗逆菌株进行冻干管制备，保存至扳倒井微生物菌种资源库，相关菌种信息录入扳倒井微生物菌种信息管理系统。

1.2.5 高酶活菌株的筛选

取新鲜活化细菌，接种于细菌种子培养基中，以37 ℃、180 r/min 摇床培养过夜，制备成菌悬液。将悬液接种于麸皮固态培养基，接种量为5%,于37 ℃培养箱中培养72 h。40 ℃烘干备用。

取新鲜活化酵母菌，接种于酵母菌种子培养基中，于28 ℃、140 r/min 摇床培养过夜，制备成菌悬液。将悬液接种于麸皮固态培养基，接种量为10%,于28 ℃培养箱培养72 h，40 ℃烘干备用。

霉菌直接挑取菌体接种于麸皮固态培养基，25 ℃培养5～7 d，40 ℃烘干备用。

淀粉酶活力测定方法：称取10 g 麸曲置于250 mL 烧杯中，加入180 mL 蒸馏水和20 mL 的pH5.5 磷酸缓冲液，搅拌均匀，35 ℃水浴锅中浸提1 h，滤纸过滤。取9 mL 1.0%淀粉缓冲液（50 ℃，预热5 min）→加1 mL酶液（立即计时，50 ℃恒温水浴准确反应30 min）→迅速吸取0.5 mL 反应液于装有1.5 mL DNS 溶液中（采用25 mL 具塞比色管）→煮沸15 min，冷却，加10.5 mL 蒸馏水（摇匀）在550 nm波长比色。

蛋白酶活力测定方法：按照SB/T 10317—1999方法进行测定。

脂肪酶活力测定方法：按照GB/T 23535—2009方法进行测定。

1.2.6 耐高温菌株的筛选

将活化后的细菌，划线接种于营养琼脂平板上，分别置于35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃静置培养48 h，观察细菌生长情况。

将活化后的酵母菌，划线接种于麦芽汁琼脂平板上，分别置于30 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃静置培养48 h，观察酵母菌生长情况。

将活化后的霉菌，三点接种法接种于察氏培养基平板上，分别置于30 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃静置培养5～7 d，观察霉菌生长情况。

1.2.7 耐酸菌株的筛选

分别用pH3.0、pH4.0 和pH5.0 缓冲液代替细菌、酵母菌和霉菌液体种子培养基中的蒸馏水，制成pH3、pH4、pH5、pH 自然的细菌、酵母菌、霉菌液体培养基。

将细菌分别接种于pH3、pH4、pH5、pH 自然的细菌液体培养基中，以35℃、180 r/min 摇床培养48 h；将酵母菌分别接种于pH3、pH4、pH5、pH 自然的酵母菌液体培养基中，以28 ℃、180 r/min 摇床培养48 h；将霉菌分别接种于pH3、pH4、pH5、pH 自然的霉菌液体培养基中，以28 ℃、180 r/min 摇床培养7 d。

生长量测定：细菌、酵母菌不同pH 值下生长量测定采用比浊法，以各自对应pH 值的空白培养基为对照，在波长600 nm 下用比色管测定培养液的吸光度值OD600；霉菌不同pH 值下生长量测定采用称干重法：将培养液用滤纸过滤，少量水洗涤，烘箱80 ℃下烘干，称菌丝干重。

2 结果与分析

2.1 扳倒井酿酒微生物的分离筛选及鉴定结果

通过分离和多次分纯对比，结合菌落外观和镜检观察，从扳倒井大曲、酒醅及窖泥中初步分离得到61 株细菌、19 株酵母菌和32 株霉菌，其中83 株分离自大曲、14株分离自酒醅、15株分离自窖泥。

细菌主要为地衣芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌、普通高温放线菌、枯草芽孢杆菌、特基拉芽孢杆菌、黄海芽孢杆菌、淤泥大洋芽孢杆菌、韩国芽孢八叠球菌、沙福芽孢杆菌、泛菌属、短杆菌属等；酵母菌主要为扣囊复膜孢酵母、异常威克汉姆酵母、伯顿丝孢毕赤酵母、库德毕赤酵母、戴尔凯氏有孢圆酵母、奇异酿酒酵母；霉菌主要为谢瓦散囊菌、黑曲霉、米根霉、绳状青霉、产黄青霉、金灰青霉、烟曲霉、溜曲霉、聚多曲霉、宛氏拟青霉、泡盛曲霉、雪白丝衣霉等。