张俊奇，佟 毅，袁敬伟，刘 辉

（1.中粮生化能源（肇东）有限公司，黑龙江肇东 151100；2.吉林中粮生化有限公司，吉林长春 130033）

我国生物燃料乙醇产业发展于“十五”初期，经历了初期试点、稳步发展和非粮乙醇发展阶段。截至2018 年，我国生物燃料乙醇年消费量近260 万吨，随着酒精需求量增加以及国家政策的实施，发展非粮乙醇成为行业大趋势[1]。

据有关部门统计，截至2016 年年末，我国水稻年库存在1.25亿吨[2]，水稻库存量大但不易保存，极易产生米质“陈化”和发霉变质[3]。水稻陈化后，不能作为口粮，也不能用于畜牧养殖，必须经过特殊加工后方可进入动物食物链环节中[4]。生产燃料乙醇是世界各国处理陈化粮的一个常用的途径[5-6]，应用陈水稻生产燃料乙醇，既能加快库存水稻流通，减少陈水稻库存积压，避免陈化粮产生，从根源上降低陈化水稻流入粮食加工市场风险，又能够缓解燃料乙醇行业原料紧缺的情况，降低企业生产成本，提升经济效益[7-8]。

响应面分析法包括试验设计、模型建立、模型合理性分析和寻求最优解等众多试验与统计技术[9]。能够有效的优化试验条件，降低实验频次，提升效率。因此，本研究采用Minitab 软件中的Plackett-Burman 设计法[10]、最陡爬坡路径法[11]、以及响应面分析法（RSM）[12]相结合，对玉米水稻原料混合发酵工艺条件进行优化研究，为复合原料或非粮原料生产燃料乙醇提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

试验材料：糖化酶、淀粉酶（诺维信公司）；安琪超级酿酒高活性酵母（安琪公司）；尿素（取自生产车间）；玉米粉（取自生产车间）；糙米粉（某粮库提供水稻，脱壳后粉碎，80%过20目筛）。

试剂：浓硫酸（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）、盐酸（分析纯）、乙醇等色谱标准品（SIGMA公司）。

仪器设备：50 L 全自动发酵罐(上海保兴生物设备有限公司)；摇床（ZHWY-2112F）；液相色谱（Agilent 1200）；离心机（3-18K）；分析天平（Mettler,AL204,ML204）；黏度计（NDJ-5S）；水浴锅（HWS-28）；pH 计（PHSJ-3F）；离心机（3-18k）；显微镜（尼康50I）等。

1.2 实验方法

1.2.1 摇瓶实验

液化条件：1 L 液化罐，液化体系为800 g，干物质浓度为30%，液化温度85 ℃，加入实验对应的淀粉酶，搅拌转速120 r/min，液化时间2.5 h。

发酵条件：1 L 三角瓶，发酵体系为350 g，酵母添加量为0.1%，温度32 ℃，加入对应辅料，发酵时间72 h。

1.2.2 发酵罐中试试验

发酵罐体积为50 L,发酵体系为35 kg；液化搅拌转速140 r/min；发酵搅拌转速120 r/min；其他条件同1.2.1 中所述。

1.2.3 检测方法

还原糖的检测：按GB/T 5009.7—2008《食品中还原糖的测定》；干物质的检测：按GB 5009.3—2010《食品中水分的测定》；淀粉、酒精度检测按照文献方法操作[13]。

1.3 实验设计

（1）Plackett-Burman 设计法筛选影响淀粉出酒率的显著性影响因素：Plackett-Burman 设计法基于非完全平衡块原理，能够通过最少实验次数评估因素的主效应，快速从众多因素中筛选出最关键的因素以供进一步研究[14-15]。本研究将酒精发酵过程中涉及到的原辅料作为影响因素进行全面考察，选择9 因子及实验次数N=12 的实验设计，每个因子取高低2 个水平，以C/F/I 作为空项以评估实验误差（表1）。

表1 Plackett-Burman 设计各因素与水平

（2）最陡爬坡路径法确定重要因子最适范围：建立有效的响应面方程需找出因子最佳值区域，以最陡爬坡法进行实验，根据各因素的效应值的大小确定步长，能够快速的逼近最佳区域[16]。

（3）响应面分析法确定最佳工艺配方：以爬坡实验得出的结果作为依据进行响应面实验，进行回归分析与误差分析，进而根据回归方程绘制响应面分析图，确定最佳工艺条件。

（4）验证实验：用所得的最佳工艺条件进行3个平行实验，以验证模型可靠性。

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman实验

Plackett-Burman 实验设计见表2，分析结果见表3。由于原料间淀粉含量存在差异，因此采用淀粉出酒率（以95%vol乙醇计）衡量发酵效果。从分析结果可以看出，对混合发酵工艺淀粉出酒率具有显著影响的因子依次是E＞H＞B＞A，即玉米粉比例＞糖化酶加量＞淀粉酶加量＞尿素加量，确定这4个因素为下一步实验的关键因素。

表2 Plackett-Burman 实验设计

表3 Plackett-Burman实验分析结果

2.2 最陡爬坡实验

通过表3 数据分析，淀粉酶加量、糖化酶加量、尿素加量为正效应，应依次增大，原料为负效应，应依次减小。爬坡实验结果见表4。

结果表明，随着尿素加量、淀粉酶加量、糖化酶加量的逐渐增加，玉米粉比例的逐渐减小，淀粉出酒率呈现出先升高后降低的趋势。当尿素加量为1.33 kg/t 粮，淀粉酶加量为0.3 kg/t 粮，玉米粉比例为40%，糖化酶加量为1.0 kg/t 粮时，淀粉出酒率达到最大，为4因子的最大响应值区域，因此以表4中试验号4 的各因素水平为中心值设计后续响应面实验。

表4 最陡爬坡路径试验结果

2.3 响应面实验

以爬坡实验确定的因子最适浓度为中心点实施响应面分析，各自变量见表5，Box-Behnken 实验设计见表6，结果分析见表7。

表5 Box-Behnken 设计因子及水平

该二次模型多元相关性系数R2=0.9823，说明仅有1.77%的变异不能由此模型解释；模型p 值=0.001，说明模型是显著的；失拟项p 值=0.283，说明模型没有失拟现象。经回归拟合后，得到二次多项式方程：

Y=16.2000+0.05583X1+0.03083X2-0.01500X3+0.09500X4-0.1558X1*X1-0.1433X2*X2-0.0396X3*X3-0.2021X4*X4-0.0075X1*X2-0.0175X1*X3-0.0125X1*X4 +0.0175X2*X3+0.0025X2*X4-0.0100X3*X4。

根据回归方程做出响应面分析图见图1。由图1 可见，当固定两个因子时，另外的两个因子处在增大过程中，淀粉出酒率呈现出先增大后减小的趋势，曲面的顶点即为淀粉出酒率的最大值。

2.4 模型验证

由模型可得，玉米粉比例38%，淀粉酶加量0.31 kg/t 粮，糖化酶加量1.02 kg/t 粮，尿素加量1.36 kg/t粮时，预测的最大响应值为55.58%。为验证模型结果，以此工艺条件进行50 L 中试验证试验，由于发酵体系放大后，发酵过程会出现醪液内部压力、物料流动性、温度传导等一系列变化，试验结果可能与小试实验存在一定差异，经3 次重复实验，结果分别为55.54%、55.59%、55.51%，平均值为55.55%，与预测值55.58%接近，证实了模型的有效性。优化后的工艺条件为：玉米粉比例38%，淀粉酶加量0.31 kg/t 粮，液化pH5.6，糖化酶加量1.02 kg/t 粮，尿素加量1.36 kg/t 粮，发酵pH4.6，发酵时间72 h。

3 结论

本研究通过Plackett-Burman 实验设计，快速有效的从影响酒精发酵的多个因素中筛选出4 个显著影响因素：玉米粉比例、淀粉酶加量、糖化酶加量、尿素加量。然后利用最陡爬坡实验法逼近最大响应值区域并通过Box-Behnken 实验设计得出最佳发酵组合：玉米粉比例38%，淀粉酶加量0.31 kg/t 粮，糖化酶加量1.02 kg/t 粮，尿素加量1.36 kg/t 粮。在最佳发酵组合条件下，淀粉出酒率可达55.55%，与由模型计算得出的最大响应值55.58%接近，说明通过响应面法优化玉米水稻混合原料发酵工艺是合理可靠的。由于实际生产情况较为复杂，本实验最佳发酵组合应用于实际生产中还需作进一步的生产试验。

对于玉米水稻混合原料发酵过程中其他因素如液化温度、液化时间、发酵温度、酒母接种量等，后续会进行深入研究，以进一步提升整体发酵水平。