李婷婷， 孙长花，2， 周舒简， 金 晶， 张亚妮， 左其生

(1. 扬州大学 江苏省动物遗传繁育与分子设计重点实验室, 扬州 225009； 2. 扬州市职业大学 生物与化工工程学院, 扬州 225009)

PGCs(Primordial germ cells)是所有生殖细胞的祖细胞，在种质资源保护、组织工程治疗等方面均有广泛应用。鸡作为一种重要的模式动物，研究其生殖干细胞PGCs的起源、迁移等机制可为禽类物种保存、良种繁育等提供重要理论参考。研究表明骨形成蛋白4(Bone morphogenetic protein 4,BMP4)参与了哺乳动物胚胎的发育，调节未分化间充质细胞的增殖和分化，在生殖细胞发育过程中，BMP4等信号调节生殖细胞分化为PGCs，启动卵子或精子分化程序，最终形成配子[1-2]。而缺失bmp4的小鼠胚层发育有缺陷，不形成PGCs或尿囊基，最终在胚胎期死亡[3-5]。BMP4是生殖细胞发生分化形成配子的重要信号之一[6]，bmp4是BMP4信号通路上的关键基因，研究表明BMP4蛋白在不同物种中的保守性较高[7-8]。

本课题组前期通过添加BMP4蛋白初步建立了鸡PGCs体外诱导模型[9]，证明bmp4基因能够调节鸡PGCs的形成，但是否与其在哺乳动物PGCs形成过程中的功能相同仍未知。因此，本研究构建bmp4的过表达及敲除载体，为详细研究bmp4在鸡PGCs形成过程中的功能和机制，分析其在鸡与哺乳动物PGCs形成过程中的差异，完善bmp4调节PGCs形成的调控网络机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

鸡胚成纤维细胞系DF-1和pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体由本实验室保存，LentiCas9-Blast、PGMLV-GM1载体由上海吉满生物技术有限公司提供。PrimeSTAR Max DNA Polymerase、XbaI、EcoR I内切酶购自TaKaRa，DMEM高糖培养基购自Hyclone，胎牛血清购自Gibico，FuGENE®HD Transfection Reagen购自Promega，嘌呤霉素、杀稻瘟菌素、TRIzol、无内毒素质粒小提中量试剂盒、荧光定量试剂盒和基因组提取试剂盒等购自北京天根生物技术有限公司，2×SoSoo同源重组酶、引物合成及测序等由北京擎科生物技术有限公司完成。……