宋国滨，王 刚，黄 颖，徐元宏

肺炎克雷伯菌由于最近几年对临床常用抗生素的耐药率呈现大幅度增长，已经跃居为院内感染的第二大致病菌，引起临床医师、临床微生物实验室医务工作者的高度重视[1]。除耐药率越来越高的特点外，其毒力基因同样受到广大医务工作者及科研工作者的关注，从1986年，Liu et al[2]报道了肺炎克雷伯菌导致的原发性侵袭性肝脓肿，伴有转移性眼内炎病例以来，越来越多的病例在国内外很多医疗机构都有报道，因其具有高毒力性、高致病性，有学者[3]将其称为高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulentKlebsiellapneumoniae，hvKP)，其细胞壁结构具有丰富的荚膜多糖导致菌落呈现高黏液表型，可以抵抗中性粒细胞对其的杀伤作用，并可借助中性粒细胞向远处转移，引起眼部和中枢神经系统感染[4]。尤其肺炎克雷伯菌引起的血流感染，导致的败血症极易增加患者的住院时间，引起患者的死亡。成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats,CRISPR)及其相关序列(CRISPR associated sequences, CAS)组成的CRISPR-CAS系统广泛存在于古细菌和细菌中，是近30年发现的天然的适应性免疫调节系统[5]。该研究着重探讨分离于安徽医科大学第一附属医院血流感染阳性的肺炎克雷伯菌的荚膜血清型、毒力相关基因的分布情况，以及与CRISPR-CAS系统的相关性，以便更好地阐明两者之间的关系，有助于为临床防控感染以及研究毒力基因的作用机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源及鉴定收集安徽医科大学第一附属医院检验科2018年1月～2019年1月保存的血流感染阳性非重复肺炎克雷伯菌，采用基质辅助激光解吸电离飞行质谱(MALDI-TOF MS)重新鉴定，质谱鉴定质控菌株大肠埃希菌8739及实验质控菌株肺炎克雷伯菌ATCC700603为本实验室所保存。

1.2 仪器与试剂高速冷冻离心机(中国heal force公司)；GeneAmp970基因扩增仪(美国PE公司)；C-880V CO2孵箱、紫外线凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)；VITEK MS质谱仪(法国生物梅里埃公司)。抗菌药物(英国OXOID公司)；琼脂糖、引物(生工生物工程(上海)股份有限公司)；标志物DNA Marker、Premix TaqTM(日本TaKaRa公司)；VITEK MS CHCA基质液(法国生物梅里埃公司)；哥伦比亚血平板(合肥天达诊断试剂有限公司)；药敏试验培养基为Muller-Hinton琼脂(江门市凯林贸易有限公司)。

1.3 药物敏感试验采用vitek-compact2仪器及纸片扩散法对肺炎克雷伯菌进行药敏试验。

1.4 高黏液表型筛选将菌株复苏接种于血平板上，在培养箱孵育22 h后，用接种环挑取单个菌落，拉丝实验的黏液丝≥5 mm为阳性[6]。

1.5 PCR检测荚膜血清型、毒力基因将菌株接种于哥伦比亚血平板上，置于37 ℃温箱中孵育18～22 h，挑取4～5个单菌落置于500 μl TE缓冲液内，在振荡器上涡旋震荡10 s，放于水浴锅内煮10 min后冰上冷却5 min，12 000 r/min离心10 min，离心后吸取300 μl上清液转移到新的EP管内，即为DNA模板。运用PCR扩增K1、K2、K5、K20、K54、K57 6种最常见荚膜血清型和rmpA、aerobactin、alls、Kfu、wcaG、magA、fimH 7种毒力相关基因。其条件为94 ℃预变性30 s，94 ℃变性60 s，50～59 ℃退火90 s，72 ℃延伸60 s，经过35个循环后，最后72 ℃延伸10 min。引物序列参考文献[7-10]、退火温度及产物大小见表1。

1.6 PCR检测CRISPR-CAS系统根据参考文献[11-12]分别扩增CRISPR-1、CRISPR-2、CAS1 3种基因，退火温度进行梯度摸索，将阳性产物送至上海生工进行测序，将测序结果于网站http://crispr.i2bc.paris-saclay.fr进行比对，CAS1阳性及CRISPR-1、CRISPR-2两个基因中至少一个基因阳性代表存在CRISPR-CAS系统，其余基因阳性组合为不存在CRISPR-CAS系统。

表1 6种荚膜血清型和7种毒力基因引物序列

2 结果

2.1 药物敏感性纸片扩散法和vitek-compact2仪器结果一致。将61株肺炎克雷伯菌分为hvKP和经典肺炎克雷伯菌(classicKlebsiellapneumoniae，cKP)2种类型,hvKP对氨苄西林天然耐药，对哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松、头孢吡肟、复方新诺明、亚胺培南、美罗培南、替加环素、多黏菌素B均敏感。cKP对氨苄西林均耐药，对哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松、头孢吡肟、复方新诺明、亚胺培南、美罗培南、替加环素、多黏菌素B的耐药率分别为48.8%、56.1%、61%、65.9%、63.4%、58.5%、44%、46.3%、41.4%、2.4%、14.6%。

2.2 肺炎克雷伯菌拉丝实验61株肺炎克雷伯菌经过拉丝实验共检出14株阳性菌，检出率为23%，经PCR检测14株高黏液型菌株rmpA基因全为阳性，定义为hvKP,其余为cKP。

2.3 荚膜血清型及毒力基因分布情况PCR检出K1型12株，K2型8株，K5、K20、K57各1株。毒力基因以fimH检出最多，为60株，检出率为98.4%，rmpA、aerobactin、alls、Kfu、wcaG、magA分别检出20、14、6、19、12、12株，检出率分别为是32.8%、23.0%、9.8%、31.1%、19.7%、19.7%。hvKP与cKP荚膜血清型及毒力基因分布情况见表2，5种荚膜血清型阳性条带图见图1，7种毒力基因条带图见图2。

表2 hvKP与cKP荚膜血清型及毒力基因分布情况[n(%)]

图1 5种荚膜血清型阳性条带图

M:Marker;1、2:K1血清型；3、4:K2血清型；5、6：K5血清型；7、8:K20血清型；9、10：K57血清型

2.4 CRISPR-CAS系统与毒力基因分布相关性经过PCR技术检测及测序，共筛选出CRISPR-CAS系统阳性菌株为11株，CRISPR-CAS系统阴性为50株，CRISPR-CAS系统阳性菌株中，有9株为hvKP，有5株同时含有rmpA、aerobactn、alls、Kfu、wcaG、magA、fimH。有3株同时含有rmpA、aerobactin、Kfu。1株只含有rmpA、aerobactin 2种基因。除fimH基因外，CRISPR-CAS系统阳性菌株其携带毒力基因数量明显高于CRISPR-CAS系统阴性菌株，经χ2检验统计学计算P<0.05，差异有统计学意义。CRISPR-CAS系统与毒力基因相关性见表3。

图2 7种毒力基因条带图

M:Marker;1、2:rmpA基因阳性;3、4:wcaG基因阳性;5、6:aerobactin基因阳性;7、8:Kfu基因阳性;9、10:alls基因阳性;11、12:magA基因阳性;13、14:fimH基因阳性

表3 CRISPR-CAS系统与毒力基因相关性(n)

*采用Fisher确切概率法比较，无χ2值

3 讨论

hvKP因其携带多个毒力基因，使其呈现高黏液表型，可以抵抗人体内中性粒细胞的杀伤作用，极易引起败血症，给患者的健康带来了严重的威胁。hvKP除了可以引起院内感染外，也可引起社区感染，正常青年人同样可以感染此种类型菌株，并易向眼部和中枢神经系统等位置远处转移。

本研究61株肺炎克雷伯菌共筛选出14株hvKP，其对抗生素的耐药性远低于普通肺炎克雷伯菌。K1和K2型荚膜血清型在6种血清型中检出率最高，且最常见、毒力最强[13]，除了在hvKP中检出到K1型，在cKP中也有检出到，与李喜红 等[14]研究一致。rmpA基因是促进肺炎克雷伯菌荚膜多糖合成的调控基因，其编码的rmpA蛋白可以促进高黏液表型的形成。本研究中，除了14株拉丝实验阳性菌株rmpA基因阳性，在拉丝实验阴性的菌株中也检测到了rmpA基因，说明高黏液表型的形成除了rmpA基因参与调控外，还需要其他毒力基因共同参与。对于很多生物来讲，铁作为一种辅助因子在生化代谢方面，电子传递等生命活动过程中起到非常重要的作用，aerobactin基因所编码产生的铁载体，可以竞争血液中的铁离子，促进菌株的生长繁殖，是肺炎克雷伯菌重要的毒力因子，有研究[15]表明，aerobactin存在可以使菌株的毒力增强100倍，本研究该基因仅存在于14株hvKP中，从侧面可以反映出菌株高黏液表型的形成与aerobactin基因的存在密切相关。值得注意的是，本研究中毒力基因fimH基因筛选数量最多，与付方俊 等[16]的研究一致，在hvKP和cKP中并没有显著区别，说明该基因并不能成为区分肺炎克雷伯菌的一个标志。magA基因编码的蛋白可以促进黏液性的形成，并参与荚膜多糖的产生，后来的研究[17]证实该基因仅存在于血清型K1菌株中，本研究结果与之一致，国内也有相关的报道[18]。wcaG基因的编码产物为胞外多糖的岩藻糖，可以避免被血液中巨噬细胞的吞噬作用所消灭，本研究中该基因也和K1型血清型分布一致，可能和K1血清型基因分布在同一质粒上，是否含有其他的机制，需要进一步研究。其他毒力基因在hvKP中的检出率明显高于cKP。

CRISPR-CAS系统是广泛存在于细菌和古细菌中的一种适应性免疫调节系统，其间隔序列与噬菌体和质粒有很高的同源性，有学者[8]认为该系统可以抵御来源于外界的核酸，经过一系列研究，证实了该系统可以对外源核酸进行切割，具体的过程分为3步：首先在适应性阶段，携带一个或多个CRISPR基因座的细菌和古生菌通过将外源序列的短片段(原间隔子)整合到宿主染色体CRISPR序列近端对外源病毒和质粒作出反应，在表达和干扰阶段，重复间隔子元件转录到为前体CRISPR-RNA(pre-crRNA)分子，然后经过酶切产生短的crRNA，可与入侵病毒或质粒的互补原间隔子序列配对,由crRNA识别目标并通过与crRNA结合的CAS蛋白来使外源核酸序列不表达达到清除外源核酸的目的。肺炎克雷伯菌的毒力基因存在于质粒中，有很多文献研究过其与耐药性之间的相关性，而与毒力基因之间存在的相关性研究不多，本研究将61株肺炎克雷伯菌分为CRISPR-CAS系统阳性菌株和CRISPR-CAS系统阴性菌株，显示CRISPR-CAS系统阳性菌株毒力基因携带率比CRISPR-CAS系统阴性菌株高，经过χ2检验差异有统计学意义，其与质粒或染色体介导的耐药基因的携带率正好相反，本研究中，hvKP除了对氨苄西林天然耐药外，对临床常用抗生素均有良好的敏感性，cKP对抗生素的耐药率较高，可能和由质粒或染色体介导的碳青霉烯酶、超广谱β-内酰胺酶、头孢菌素酶的传播有关，其具体的耐药机制还应通过相关实验从分子基因水平进行验证，另外在细菌的进化过程中，耐药基因的获得对细菌的生长起到非常重要的作用，但并不是任何的质粒都能被细菌所接受，仍然需要平衡细菌获得质粒所需能量与细菌所产能量之间两者的关系。Palmer et al[19]的研究表明，CRISPR-CAS系统阳性菌株其耐药率比阴性系统低，本研究通过χ2检验经过计算CRISPR-CAS系统与耐药性之间的相关性，差异无统计学意义，可能与样本数量少有关，对于质粒介导的毒力基因和CRISPR-CAS系统相关性的分子机制仍需要进一步研究。