胡巧丽，许志强，潘晨，朱理想，魏继福

蒿属类花粉是一种重要的过敏原，广泛分布于世界各国[1]。中国有187种蒿属植物，分布遍及全国[1]，与夏秋季花粉症密切相关[2]。大籽蒿花粉是我国常见的致敏花粉之一，其点刺液广泛用于临床蒿属过敏诊断[3]。然而，大籽蒿花粉致敏组分的蛋白类别、序列信息及致敏情况尚无深入研究。

肌动蛋白(组装)抑制蛋白(profilin)致敏性在多个物种中均有报道，如花粉、食物、胶乳等，并且存在广泛的交叉致敏性[4-6]。本研究通过转录组学法对大籽蒿花粉中的profilin进行鉴定和表征，并综合分析大籽蒿profilin的潜在IgE结合表位和三维结构特征，以完善大籽蒿花粉的过敏原信息。

1 材料与方法

1.1 材料

大籽蒿花粉转录组测序由北京奥维森基因科技有限公司完成，DNA引物序列合成及克隆菌基因测序均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。PCR试剂盒、T/A克隆试剂盒(pMD19-T载体)、DNA胶纯化试剂盒、NcoⅠ和XhoⅠ酶、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)等均购于宝生物工程(大连)有限公司。重组克隆试剂盒购于诺维赞公司。TMB显色液、ELISA终止液购于碧云天生物技术公司，ECL显影液和PVDF膜购于Merck集团。Anti-IgE购于美国KPL公司。

1.2 方法

1.2.1 大籽蒿花粉profilin基因扩增和克隆

根据转录组测序结果，使用局部序列比对工具(BLAST)，将测序得到的剪接序列与IUIS数据库中收集的已知profilin序列进行比较，找到一个潜在的profilin序列并设计全长引物(图1)，进行PCR扩增、TA克隆和重组克隆。

1.2.2 大籽蒿花粉profilin表达纯化

提取重组菌的质粒，转化到BL-21感受态细胞中，用终浓度1 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导，并通过SDS-PAGE筛选成功表达的菌落进行大规模诱导培养。随后超声裂解菌体，利用SDS-PAGE凝胶电泳确定蛋白表达形式，并通过Ni-NTA凝胶对目的蛋白进行纯化。若以包涵体表达，则在含8 mol/L尿素的变性条件下进行纯化并梯度透析除去尿素。

1.2.3 酶联免疫吸附试验

将10 μg/mL纯化的大籽蒿profilin，4 ℃包被过夜。将蒿属过敏患者血清1∶10稀释作为一抗，酶联免疫吸附试验(ELISA)方法与Lin[7]描述相同。

1.2.4 免疫印迹试验

10 μg纯化的大籽蒿profilin上样跑电泳，以ELISA阳性血清1∶10稀释作为一抗，免疫印迹试验(Western blot)方法与Kim[8]描述一致。

1.2.5 大籽蒿花粉profilin保守性分析

根据所鉴定大籽蒿花粉中profilin的氨基酸序列，利用clustalX2与其他物种中的profilin进行多重序列比对，包含花粉类过敏原艾蒿Art v 4、豚草Amb a 8、桦树Bet v 2、橄榄树Ole e 2和向日葵Hel a 2，食物类过敏原花生Ara h 5和榛子Cor a 2及接触类过敏原胶乳Hev b 8(http://www.aller-gen.org/)。明确大籽蒿花粉profilin中高度保守的氨基酸序列。

1.2.6 大籽蒿花粉profilin结构模拟

利用同源模拟法对其结构进行分析。首先在SIWSS-MODEL服务器(https://swissmodel.expasy. org/)中导入profilin的氨基酸序列，选取与其序列一致性最高的模板进行模型构造，并利用procheck、ERRAT、Verify 3D、ProSA和QMEAN法对所得结构模型质量进行评价。

图 1大籽蒿花粉profilin核苷酸序列和氨基酸序列

Fig1Nucleotide and amino acid sequence ofArtemisiasieversianapollen profilin

1.2.7 大籽蒿花粉profilin IgE表位分析

结合大籽蒿花粉profilin氨基酸残基的物理化学性质和所获得的三维结构模型，对其B细胞表位进行综合分析。首先，在DNASTAR中通过亲水性、柔性、表面可及性和抗原性参数筛选符合条件的线性表位；随后使用结合hidden Markov模型和倾向量表法的Bepipred 1.0程序，设定分数阈值为0.35，预测潜在的B细胞线性表位[9]；最后，结合profilin三维结构模型，使用ElliPro程序并设定最小分值为0.5，进一步分析线性表位序列。综合三种方法所得结果，选取同时被两种以上方法断定为表位的共同序列作为最终线性B细胞表位结果。同时，使用Ellipro和SEPPA 3.0两种工具对大籽蒿花粉profilin的构象性B细胞表位进行预测分析[10-11]，综合两种方法所得共同的序列作为最终结果。

2 结果

2.1 大籽蒿花粉profilin基因扩增和克隆

大籽蒿花粉总RNA逆转录和PCR扩增后，经琼脂糖凝胶电泳验证，获得一个大小约为400 bp的片段(图2)，回收后依次进行TA克隆和重组克隆并测序。大籽蒿花粉profilin序列编码区含有402个碱基，编码133个氨基酸(图1)，前引物和后引物位置用下划线标注。

图 2 大籽蒿花粉profilin PCR扩增结果Fig 2 PCR amplification of Artemisia sieversiana pollen profilinM:DNA marker DL2000; 1:大籽蒿proflin基因扩增

2.2 大籽蒿花粉profilin表达纯化

profilin蛋白以包涵体形式在相对分子质量13 000附近表达(图3A)。利用重组蛋白C-末端的组氨酸标记，在变性条件下使用高亲和力的Ni-NTA树脂对包涵体进行纯化，使用SDS-PAGE分析发现纯化效果较好(图3B)，收集的洗脱液梯度透析到PBS中进行蛋白复性。

2.3 大籽蒿花粉profilin ELISA

大籽蒿花粉profilin ELISA以10份阴性血清的吸光度值计算：cut-off值=x+3s，结果为0.209 7(图中以虚线标出)。50份蒿过敏血清中11份血清的ELISA值高于cut-off值，阳性率为22%(图4)。

2.4 大籽蒿花粉profilin Western blot

对11份ELISA阳性血清进行Western blot分析，一份阴性血清作对照。发现其中5份血清含有IgE且能与大籽蒿花粉profilin结合而显示出阳性条带(图5)。

图 3大籽蒿花粉profilin表达纯化

Fig3Expression and purification ofArtemisiasieversianapollen profilin

A:profilin诱导表达图;M.蛋白marker26616;1.未诱导菌;2.诱导菌;3.诱导菌超声裂解后的上清;4.诱导菌超声后的沉淀(包涵体);箭头表示重组profilin

B:profilin纯化图;M.蛋白marker26616;1.诱导菌超声后的沉淀;2.穿透液;3.50 mmol/L咪唑洗脱液; 4.200 mmol/L咪唑洗脱液;箭头表示纯化profilin

Mr:相对分子质量

2.5 大籽蒿花粉profilin保守性分析

通过多重序列比对，大籽蒿花粉profilin与花粉、食物及胶乳中profilin均具有较高序列一致性(图6)。其中大籽蒿花粉profilin与其近缘物种艾蒿花粉两个profilin过敏原Art v 4.0101和Art v 4.0201的氨基酸序列一致性最高，分别为86%和99%；与豚草Amb a 8、向日葵Hel a 2、桦树Bet v 2、橄榄树Ole e 2、花生Ara h 5、榛子Cor a 2和胶乳Hev b 8的序列一致性分别为81%、85%、70%、76%、69%、72%和70%。图6比对结果中方框所示为保守区序列，黑色高亮区域为此10种profilin过敏原中100%一致的氨基酸残基。

图 4 大籽蒿花粉profilin ELISAFig 4 ELISA of Artemisia sieversiana pollen profilin

图 5 大籽蒿花粉profilin Western blotFig 5 Western blot of Artemisia sieversiana pollen profilin图中数字为患者血清编号，与ELISA中患者血清编号对应；NC：阴性血清

图 6大籽蒿花粉profilin与其他物种中同源过敏原的多重序列比对

Fig6Multiple sequence alignment ofArtemisiasieversianapollen profilin with homologous allergens from other species

2.6 大籽蒿花粉profilin三维模型的构建及结构分析

通过序列相似性比对，艾蒿花粉Art v 4.0101(PDB number：5EM0)与大籽蒿花粉profilin氨基酸序列一致性为86.36%，选择其模型作为模板对大籽蒿花粉profilin进行同源建模(图7A)。从大籽蒿花粉profilin结构模型的拉氏图可见91.6%的氨基酸残基位于偏好区(most favored regions)，剩余8.4%的氨基酸残基位于允许区(图7B)。通过ERRAT程序分析，模型的综合品质因数为97.368(图7C)，并且在Verify3D分析中，99.24%的氨基酸残基的3D-1D分值≥0.2。另外，模型的Z-score、GMQE和Qvalue分别为-6.74(图7D)、0.97和-0.24。所有验证分析均表明通过同源建模所得的大籽蒿花粉profilin的模型立体化学结构合理、分辨率高、质量较好。

模型结构显示，大籽蒿花粉profilin含有4个α螺旋结构，分别位于3-10、46-57、63-65和114-131，另外含有7个β折叠结构，分别位于23-29、35-37、67-69、72-76、83-89、92-98和102-108，这些α螺旋和β折叠结构在序列比对结果中分别以α1～α4和β1～β7标示(图6)。

2.7 大籽蒿花粉profilin B细胞表位预测

在DNASTAR软件中，基于亲水性、柔性、表面可及性和抗原性参数，得到5个线性B细胞表位；Bepipred 1.0预测得到4个线性表位；通过Ellipro分析得到7个线性表位。综合三种工具所得结果，最终共有5条线性B细胞表位：17-21, 37-47, 85-91, 109-115, 126-133，并以B1、B2、B3、B4和B5在三维结构中标示(图8A，表1)。

对大籽蒿花粉profilin的构象性表位分析中，Ellipro共得出10条构象性B细胞表位。根据SEPPA 3.0所预测的表位残基信息，结合模型表面结构，得出3条构象性表位。综合Ellipro和SEPPA 3.0的结果一致区域，最终获得3条构象性B细胞表位序列：(13-14)-(16-20), (59-61)-(64), (99-101)-(133)，以CB1、CB2、CB3标示于大籽蒿花粉profilin空间结构上(图8B，表1)。

3 讨论

蒿属以其分布广泛和花粉产量高的特点，被认为是中国最重要的户外过敏原之一[12]。本研究对大籽蒿花粉的新致敏蛋白组分profilin及其致敏表位进行了深入研究。通过多重序列比对，发现大籽蒿花粉profilin与其近缘物种艾蒿中已报道的两种profilin具有非常高的保守性，氨基酸一致性分别为86%和99%，另外与花粉、食物及胶乳中profilin的序列一致性也均在65%以上。进一步对大籽蒿profilin的免疫学活性进行研究发现其致敏率为22%，与其他花粉profilin的致敏率相似，如艾蒿Art v 4的致敏率为36%(36/100)[13]，桦树Bet v 2为22%(55/242)[14]，向日葵Hel a 2为30.5%(37/121)[15]。对11份ELISA阳性血清进行Western blot发现仅有5份血清有条带。可能的原因是与免疫学活性相关的构象性表位在Western blot过程中被破坏，提示构象性表位在profilin致敏中具有重要作用。

图 7大籽蒿花粉profilin蛋白三维结构和验证

Fig7Three dimensional structure of profilin fromArtemisiasieversianapollen and the verification

A:以Cartoon模式展示的三维结构;B:三维结构的拉氏图分析;C:三维结构的综合质量因数分析;D:B细胞表位预测

图 85个线性表位和3个构象性表位在大籽蒿花粉profilin蛋白结构上的位置

Fig8Positions of 5 linear epitopes and 3 conformational epitopes on the structure ofArtemisiasieversianapollen profilin

A:线性表位； B:构象性表位

表1 大籽蒿花粉线性表位和构象性表位综合分析Table 1 Linear and conformational epitopes of Artemisia sieversiana pollen profilin

本研究中不仅进行了线性表位分析，还对其构象性表位进行了综合预测，得到大籽蒿花粉profilin的5个线性B细胞表位：17-21, 37-47, 85-91, 109-115, 126-133和3条构象性B细胞表位：(13-14)-(16-20), (59-61)-(64), (99-101)-(133)。从图8可见，这些表位均位于大籽蒿花粉profilin蛋白表面并且大都分布于蛋白的无规则卷曲处，并且存在一定的重合性，如线性表位B1是构象表位CB1的一部分。另外，先前对向日葵花粉和甜瓜B细胞表位的研究表明41-48、66-75、81-93、95-99和122-131是profilin过敏原具有交叉致敏性和成为泛过敏原的重要IgE结合表位[16-17]，与本研究所预测的大籽蒿花粉profilin的B2、B3和B5三个表位具有一定的保守性。由于本研究所分析的IgE结合表位均是基于多种工具综合预测法，每个表位的具体IgE结合活性仍需要通过实验验证。

总结来看，本研究发现大籽蒿花粉profilin与其他花粉、食物及胶乳等多种物种中的profilin过敏原具有非常高的同源性。大籽蒿花粉profilin在蒿属花粉过敏患者中的致敏率为22%，也与其他花粉过敏原相似。另外，利用同源模拟，构建大籽蒿花粉profilin的三维结构模型，得到了5个线性B细胞表位和3个构象性B细胞表位。这些结果不仅进一步完善了大籽蒿花粉的致敏原组分信息，还为未来个体化组分解析诊断和低致敏疫苗的研制提供了重要的基础。