王丽强 刘 欢 罗振国

佳木斯大学附属第一医院泌尿外科，黑龙江省佳木斯市 154003

前列腺癌是男性中最常被诊断出的癌症，并且是美国癌症死亡的第二大主要原因[1]。尸检研究发现，年龄<30岁的男性中有5%，>79岁的男性中有59%患有前列腺癌[2]。研究表明，前列腺癌与遗传因素密切相关，且和人种、地区以及饮食等有一定相关性[3]。在中国，最近几年前列腺癌的发病率一直在增加。尽管前列腺癌诊断治疗方面取得了进步，但患者的总生存率并未得到明显提高。同多数癌症一样，其致癌机制仍未完全明了，其临床病理上表现为异质性多灶性疾病。因此，寻找前列腺癌发生及发展过程中的关键基因，对于患者的靶向治疗颇具意义。VSTM2L基因在人类基因组中的位置位于chr20:37 903 104～37 945 350，长度为42 247bp，正常情况下主要表达于脑组织。有研究表明VSTM2L基因在结直肠癌及乳腺癌中表达上调[4-5]。Dorian R.A.Swarts等人使用基因表达谱分析探讨肺类癌进展中涉及的途径时证明VSTM2L基因低表达与患者预后正相关，但是其基因的功能及其通路没有进一步验证[6]。GEPIA数据库分析表明VSTM2L基因在前列腺癌中表达值高于正常组织(P<0.05)。据我们所知在前列腺癌中尚没有研究VSTM2L的文献，关于VSTM2L在前列腺癌中的表达及意义知之甚少。因此，我们决定采用组织芯片结合免疫组织化学检测前列腺癌中的VSTM2L蛋白，测定了前列腺正常组织、癌旁及癌组织中VSTM2L的蛋白表达，研究了前列腺癌组织中VSTM2L蛋白相对表达量与患者临床病理参数之间的相关性，以探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 前列腺癌组织芯片购于上海芯超生物科技有限公司。组织芯片名称及编号:前列腺癌组织芯片HProA100PG03，附赠临床病理资料及HE电子扫描图片。芯片包括正常组织3例、癌旁组织2例及癌组织94例。筛选出进行临床病理相关性分析的合格例数92例，年龄56～96岁，中位年龄71岁。病理学上分化中等19例，分化差或未分化73例。淋巴结阴性者37例，阳性者3例，其余52例淋巴结数据缺失。

1.2 免疫组化主要试剂 VSTM2L多克隆兔抗人抗体购自上海优宁维生物科技股份有限公司，货号HPA043832，供应商为Atlas Antibodies AB。UltraSensitive S-P免疫组化试剂盒，福州迈新。苏木素，sigma aldrich。抗体稀释液，Dako。

1.3 方法 步骤：将组织芯片放入烘箱中，温度调至63℃，烘蜡1h。芯片烘烤完毕后，放入全自动染色机进行脱蜡。使用DAKO 全自动免疫组化预处理系统进行抗原修复。芯片修复后用PBST缓冲液冲洗3次，1min/次；按试剂说明稀释度用抗体稀释液稀释为1∶100，滴加一抗，4℃冰箱过夜。室温复温30min，将片子用PBST缓冲液冲洗3次，1min/次。滴加生物素标记二抗孵育10min，PBS冲洗3次， 3min/次。 除去PBS液，每张切片加1滴链霉菌抗生物素—过氧化物酶溶液室温下孵育10min。PBS冲洗3次， 3min/次。滴加DAB 显色液，苏木素复染，1%盐酸酒精分化，中性树胶封片，置显微镜下观察，Aperio扫描仪扫描组织芯片。

结果判定：使用Aperio ImageScope病理图片查看软件对每张病理组织切片在200倍放大下截取4张不同位置癌灶图片，采用image pro plus 6.0图像分析软件分析每张图片选定癌灶的平均光密度值,再以4张图片平均光密度值的平均值作为每张病理切片VSTM2L蛋白最终相对表达量。在结果认定中，小于中位数视为低表达，大于中位数视为高表达。

2 结果

2.1 VSTM2L蛋白在前列腺正常组织、癌旁及癌组织中的表达水平 组织芯片HE染色及VSTM2L免疫组化整体扫面结果(见图1)。VSTM2L蛋白在3例前列腺正常组织，2例癌旁及94例癌组织中均有表达，正常组织表达弱阳性，主要位于腺体细胞质中，癌旁组织表达中等阳性，主要位于腺体细胞质、细胞膜及部分间质组织中，癌组织表达量显著高于正常组织及癌旁组织，表现为细胞质、细胞膜或部分细胞核中的棕黄色染色，多数病例间质染色。但三组间平均表达量差异无统计学意义(P>0.05)(见图2、3)。

图1 HProA100PG03组织芯片HE及VSTM2L

2.2 VSTM2L蛋白在前列腺癌组织中的表达与临床病理变量的关系 相对于中位数，VSTM2L蛋白免疫组化表达量被分类为低或高。为进一步研究VSTM2L，本研究分析了VSTM2L蛋白表达状态与常用临床病理参数之间的关系。前列腺癌组织中VSTM2L蛋白表达与前列腺癌患者Gleason评分、年龄、病理分级相关(P<0.05)，但是VSTM2L蛋白表达与淋巴结转移无关(P>0.05)，见表1。

图2 各组织中VSTM2L蛋白表达情况 (SP×200)

A:正常前列腺组织 B:前列腺癌旁组织 C:前列腺癌组织

图3 VSTM2L蛋白在前列腺良恶性组织中的表达

表1 VSTM2L蛋白表达与前列腺癌临床病理特征的相关性分析

3 讨论

Lara Rossini等人在研究神经保护剂Humanin(HN)细胞毒性和在神经毒性损伤具有保护活性中，描述了一种新的HN神经保护活性调节剂的鉴定(VSTM2L)，以前称C20orf102[7]。VSTM2L在酵母和哺乳动物细胞中与HN相互作用，在培养的细胞中分泌，存在于血清中，并在中枢神经系统中选择性表达[7]。VSTM2L基因在GEO数据库GSE803芯片正常前列腺组织本底表达量相对于其他正常组织处于中等水平[8]。最新发表于BMC Bioinformatics的文章整合利用微阵列和RNA-Seq技术获得来自不同乳腺癌数据集的异质癌细胞系，证实了所获得的基因组作为乳腺癌可能的生物标志物的有效性，通过特征选择过程，由六个基因组成的最终小子集被考虑用于乳腺癌诊断，前6位表达基因分别为SFRP1、GSTM3、SULT1E1、MB、TRIM29、VSTM2L，这些基因与它们参与乳腺癌之间的关系中，前五个基因以前被报道为乳腺癌中的基因，虽然在乳腺癌组织中检测到VSTM2L，但迄今为止，其表达与目前文献中的乳腺癌发展关系仍有待证实[9]。2012年葡萄牙肿瘤研究所领衔的研究原发性前列腺癌不同ETS重排的特异性和共有靶基因时，使用表达阵列数据鉴定出ETV1阳性前列腺癌中包括VSTM2L基因在内的15个靶基因特异性失调[10]。

据我们所知，这是首次研究VSTM2L与前列腺癌之间关联性的文章。本研究的主要发现有如下两点：首先，免疫组化分析发现，与前列腺正常及癌旁组织相比，前列腺癌组织中的VSTM2L蛋白表达上调，但由于前列腺正常及癌旁组织样本量太小，代表性较差，统计学上存在偏倚，与GEPIA数据库VSTM2L基因表达结果存在差异，仍需进一步扩大样本量；第二，这是描述VSTM2L蛋白对前列腺癌患者Gleason评分、病理分化等级意义的第一份报告。VSTM2L蛋白高表达与前列腺癌患者Gleason评分、病理分化和年龄之间存在相关性。不过由于组织芯片详细资料缺少T分期、远处转移及临床分期情况、生存资料，因此未能进行更详细的临床相关性及评估对患者生存期的影响。VSTM2L在前列腺癌中的高表达暗示其有促肿瘤作用、与不良预后可能有关，可能作为前列腺癌的潜在治疗靶点。但前列腺癌中VSTM2L表达改变的确切分子机制尚不清楚，需要进一步的体外和动物研究以验证前列腺癌发生发展中VSTM2L表达改变的真正分子机制。