段群棚，张艺杰，2，赵硕，2，周英宁，蒋冬福，秦毅斌，卢冰霞，李斌，陈忠伟，梁家幸，赵武，何颖*

(1. 广西兽医研究所/广西兽医生物技术重点实验室，广西 南宁 530001；2. 广西大学动物科学技术学院，广西 南宁 530005)

近年来，养猪产业逐渐走向规模化集约化，饲养密度越来越大，各国家各地区间贸易往来增多，猪呼吸道疫病在世界范围内广泛危害养猪业。上世纪90年代初，我国从国外引进种猪，从此多种呼吸道疾病传入中国并开始大范围流行，而我国的疫苗研制等综合防治措施比较落后，如今猪呼吸道疫病已经上升为规模化猪场的主导疾病，发病率为30%～80%左右，死亡率极高，造成了极大的经济损失[1]。呼吸道疫病多发生于断奶仔猪、育肥猪、保育猪和母猪等，病猪多表现为发热、咳嗽、呼吸困难、体温升高和体重下降等，病死猪剖检可见明显的肺部病变[2-3]。规模猪场中猪的呼吸道疫病病因复杂，通常伴随着多种病原的混合感染和继发感染[4-6]。病原主要包括猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环2病毒(PCV2)、伪狂犬病毒(PRV)、猪肺炎支原体(Mhp)和胸膜肺炎放线杆菌(APP)等原发性感染病原和副猪嗜血杆菌(HP)等继发性感染病原[2-3，7]。原发性感染病原侵入呼吸道和肺脏后，破坏呼吸道的防御屏障，造成猪呼吸道的抵抗力下降，猪体内的内源性继发病原体和环境中的外源性继发病原体进入呼吸道，引发继发性混合感染，暴发呼吸道疫病[2-3，8-10]。感染的病原不同靶器官也会不同，多种病原混合感染则造成多种病理变化，因此使得呼吸道疫病的临床诊断极为困难[6]。猪呼吸道疫病在我区猪场中普遍存在，对养猪业的发展造成了极大的影响[3]。为掌握广西地区猪场主要呼吸道疫病的流行情况，广西兽医研究所病毒研究室于2015年3月至2019年2月采用RT-PCR/PCR方法和细菌分离技术对广西地区14个地市猪场送检的1 114份具有呼吸道症状病猪样品进行CSFV、PRRSV、PCV2、PRV、Mhp、HP和APP等7种疫病病原检测，并分析病原阳性率在不同年份、不同季节之间的差异及病原混合感染的情况，为广西地区主要猪呼吸道疫病的防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料样品来源

1 114份具有呼吸道症状病猪样品为被动送检样品，分别于2015年3月至2019年2月采集自广西14个地市规模猪场具有呼吸道症状病猪，其中南宁438份、玉林253份、桂林84份、贵港54份、百色47份、柳州43份、崇左39份、贺州32份、河池29份、北海27份、钦州23份、防城港19份、来宾18份和梧州8份。

1.1.2 主要试剂

DL2000 DNA Marker、2×TaqPCR Master Mix、反转录试剂盒(PrimeScript RT reagent Kit) 均为大连宝生物工程有限公司产品；病毒基因组DNA/RNA快速抽提试剂盒为Axygen 生物科技有限公司产品。

1.1.3 细菌分离培养

将送检具有呼吸道症状病猪的肺脏、肾脏、脾脏、肝脏、心脏和淋巴等组织样品分别无菌操作接种于TSA血清琼脂、普通营养琼脂、麦康凯琼脂以及加有NAD的胰蛋白胨大豆营养琼脂等不同培养基平板，置37 ℃分别进行需氧与厌氧培养，24～48 h后观察生长情况及菌落特征，并取菌落进行革兰染色涂片进行镜检。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成

根据GenBank 中公开发表的各病毒的基因序列，利用Meg Align(DNAStar)，Primer Premier 7.0软件设计引物(表1)，上述引物均送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2 病料处理、病毒DNA/RNA提取和细菌DNA模板的制备

取送检具有呼吸道症状的病猪肺脏、肾脏、脾脏、淋巴等组织样品，按1∶5加入生理盐水，在组织研磨器内进行研磨，反复冻融3次，4 ℃条件下10 000 r/min离心5min后取上清，进行DNA/RNA抽提或保存于-70 ℃冰箱备用。按照 AxyPrep Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit使用说明书对样品上清进行DNA/RNA提取，所获得的DNA/RNA直接进行PCR/RT-PCR或置于-70 ℃保存。挑取细菌培养基疑似菌落，悬浮于10 μL PBS中，95 ℃ 水浴10 min，5 000 r/min离心1 min后取上清作为DNA模板，所获得的DNA模板直接进行PCR或置于-70 ℃保存。

表1 引物信息

病原引物序列(5'→3')GenBank登录号退火温度/ ℃产物长度/bpCSFVP1:TCGACAACCAATGAGATAGGGP2:CACAGCCCAAATCCAAAGTCATCAF09150755288PRRSVP3:AGGTGGGCAACCGTTTTAP4:CATCACTGGCGTGTAGGTAATAF102506.257738PCV2P5:CCGCGGGCTGGCTGAACTTP6:ACCCCCGCCACCGCTACCDQ220735561 154PRVP7:CAGGAGGACGAGCTGGGGCTP8:GTCCACGCCCCGCTTGAAGCTNC00615161217MhpP9:GAGCCTTCAAGCTTCACCAAGAP10:TGTGTTAGTGACTTTTGCCACCNC01750956648HPP11:GTGATGAGGAAGGGTGGTGTP12:GGCTTCGTCACCCTCTGTCP00538455826APPP13:TGGCACTGACGGTGATGAP14:GGCCATCGACTCAACCATCP00068755422

1.2.3 病毒目的基因片段扩增

1.2.3.1 CSFV和PRRSV的RT-PCR检测

利用特异性引物对提取的样品RNA进行RT-PCR扩增，反转录体系10 μL：RNA模板7 μL，5×Prime-ScriptTM稀释液2 μL，RT Enzyme Mix 0.5 μL，下游引物0.5 μL。反转录条件：42 ℃ 40 min，94 ℃ 5 min，反应产物于-20 ℃保存备用。PCR扩增体系25 μL：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，反转录产物(cDNA)3 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR扩增反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，按表2退火温度退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。反应结束后取10 μL PCR扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统上观察结果并拍照。

1.2.3.2 PCV2、PRV、Mhp、HP和APP的PCR检测

利用特异性引物对提取的样品DNA或细菌DNA模板进行PCR扩增，PCR扩增体系同PCV2的PCR扩增反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，按表2退火温度退火40 s，72 ℃延伸70 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。

PRV、Mhp、HP和APP的PCR扩增反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，按表2退火温度退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。电泳及结果观察同1.2.3.1。

1.2.4 数据处理与分析

分析7种病原的阳性率在不同年份、季节的之间的差异和病原混合感染情况。同一份样品只能检测到1种病原阳性的归为单一感染，同时检测到2种病原阳性的归为二重感染，同时检测到3种病原阳性的归为三重感染，同时检测到4种病原阳性为四重感染，依次类推。

2 结果与分析

2.1 7种病原RT-PCR/PCR检测

各病原经特异性引物扩增，PCR产物电泳后，在紫外线光下可分别观察到大小为288(CSFV)、738(PRRSV)、1 154(PCV2)、217(PRV)、648(Mhp)、826(HP)和422(APP)的条带(图1)，与预期片段大小相符，表明本试验设计的引物特异性强。

2.2 不同年份猪场送检样品7种病原检测

由表2可知，2015—2019年，CSFV样品阳性率分别为12.35%、12.99%、5.49%、8.11%和26.67%；PRRSV样品阳性率分别为48.15%、59.32%、36.63%、43.41%和58.89%；PCV2样品阳性率分别为56.79%、54.80%、36.63%、31.03%和42.22%；PRV样品阳性率分别为4.94%、6.21%、8.42%、4.87%和7.78%；Mhp样品阳性率总体呈下降趋势，分别为9.88%、6.78%、4.03%、4.26%和1.11%；HP样品阳性率分别为22.22%、35.03%、29.30%、18.66%和33.33%；APP样品阳性率呈逐渐下降趋势，分别为6.17%、3.39%、2.20%、0.81%和0。

M.DL2000 DNA Marker；1. CSFV；2. CSFV阴性对照；3. PRRSV；4. PRRSV阴性对照；5. PCV2；6. PCV2阴性对照；7. PRV；8. PRV阴性对照；9. Mhp；10. Mhp阴性对照；11. HP；12. HP阴性对照；13. APP；14. APP阴性对照

图1 7种病原的RT-PCR/PCR电泳

2.3 不同季节猪场送检样品7种病原检测

由图2可知，CSFV样品阳性率在冬、秋季较高，分别为11.92%和11.15%；在春、夏季较低，分别为8.37%和7.56%。PRRSV样品阳性率在秋季最高，为53.44%；其次是春、夏季，分别为45.81%和43.28%，冬季最低，为40.99%。PCV2样品阳性率在夏、冬季较高，分别为45.38%和41.57%；在秋、春季较低，分别为34.43%和34.36%。PRV样品阳性率在冬季最高，为8.14%；其次是夏、春季，分别为5.88%和5.73%；秋季最低，为4.59%。Mhp样品阳性率在夏、秋季较高，分别为7.14%和4.92%；在春、冬季较低，分别为4.41%和3.20%。HP样品阳性率冬季最高，为30.52%；其次是秋、春季，分别为27.54%和22.47%；夏季最低，为17.65%。APP样品阳性率在春季最高，为3.08%；其次是冬、秋季，分别为2.03%和1.64%；夏季最低，为0.84%。

表2 2015—2019年猪场呼吸道疾病样品7种病原阳性率检测结果 %

2.4 2015—2019年猪场送检样品7种病原混合感染检测

由表3可知，2015—2019年送检的猪呼吸道疫病样品中，CSFV、PRRSV、PCV2、PRV、Mhp、HP和APP这7种病原均存在不同程度的单一感染情况，PRRSV(16.52%)单一感染率最高，其次是PCV2(9.78%)；混合感染包括二重感染、三重感染、四重及以上感染，其中又以二重感染较为常见(29.10%)，二重感染以PRRSV+PCV2(10.77%)、PRRSV+HP(6.10%)和PCV2+HP(4.49%)为主；其次是三重感染(9.62%)，三重感染以PRRSV+PCV2+HP(4.49%)为主；四重及以上感染较少，在5年间仅检测到22例；二重感染、三重感染、四重感染组合均形式多样，感染情况较复杂。

图2 2015—2019年不同季节猪场样品7种病原检测结果

表3 2015—2019年猪场样品7种病原混合感染检测结果 %

续表3

3 讨论

在临床症状及病理剖检的初步诊断基础上，课题组于2015年3月至2019年2月对广西14个地市规模猪场送检的1 114份具有呼吸道症状病猪样品进行7种猪主要呼吸道疫病病原检测。检测结果表明，猪呼吸道疫病在广西普遍存在，其中 PRRSV的样品阳性率最高，PCV2和HP次之。7种病原之间的混合感染普遍存在，其中主要以PRRSV、PCV2和HP引起的混合感染为主，除二重感染以外，还有三重和四重混合感染，甚至存在22例五重及六重混合感染情况，且不仅存在病毒与病毒间混合感染，还存在病毒与细菌、细菌与细菌间混合感染，混合感染方式多样。1头病猪存在多种病原混合感染，这与四川省报道的混合感染情况相一致[6]。调查结果进一步说明混合感染已成为近年猪呼吸道疫病发病态势，广西地区猪呼吸道疫病仍呈多发而且以混合感染为主要态势，疫情复杂，需引起高度重视，采取针对性有效防控措施。

2015—2019年，PRRSV的阳性率为45.87%，是广西地区猪呼吸道疫病阳性率最高的病原，而PRRSV单一感染仅为16.52%，其余均为混合感染，且混合感染形式多样，混合感染又以二重感染较为常见，其中PRRSV的二重感染以PRRSV+PCV2、PRRSV+HP为主，三重感染次之，三重感染以PRRSV+PCV2+HP为主。PRRSV全年均有较高的发病率，无明显的季节性。调查结果充分说明PRRSV仍是广西猪呼吸道疫病感染的主要病原，且以混合感染形式为主。分析可能原因：PRRSV为RNA病毒，具有高度变异的特点，基因的点突变、缺失和重组频繁，导致毒株多样性显著，不同毒株在抗原性及致病性等方面存在一定差异，难以实现合理的交叉保护，且PRRSV采取多种途径逃逸机体的免疫识别，至今还未能研制出一个理想的、能有效预防PRRSV 感染的疫苗[11-15]；PRRSV具有抗体依赖性增强作用(ADE)，当机体中和抗体水平低至免疫保护水平时，PRRSV 能够和抗体结合产生抗原抗体复合物，经过内吞方式侵入宿主细胞，促进病毒增殖。另外，PRRSV弱毒疫苗在免疫接种时也可能会出现 ADE，主要原因在于疫苗免疫初期机体诱导产生低水平的中和抗体，这将促进野毒株入侵宿主细胞并增值复制，进而导致免疫失败[16-18]；PRRSV可以通过其编码蛋白来抑制干扰素的产生和阻碍干扰素激活的抗病毒信号通路，从而造成PRRSV在猪体内持续性感染[19]；PRRSV可感染各种年龄段的猪群，对免疫系统造成严重损伤，导致免疫抑制，从而会继发感染许多细菌病和其他的病毒病，使疫情变的更加复杂[20-21]。

PCV2的阳性率为38.96%，也是引起广西地区猪呼吸道疫病的主要病原。PCV2单一感染为9.78%，其余均为混合感染，说明PCV2同PRRSV一样，主要以混合感染为主。PCV2以与PRRSV的混合感染为主，除与PRRSV等病毒混合感染外，与细菌的混合感染也较为常见，如PCV2+HP等。研究表明，PCV2单独感染后发病或表现出临床症状的只有10%～20%，但与其他病毒或细菌发生混合感染后可出现严重复杂的症状和病理变化，死亡率也大大增加，特别是与PRRSV混合感染且表现出PRRSV症状的猪几乎都会死亡[22-24]。PCV2主要侵害感染猪的免疫系统，导致机体抵抗力下降，引起发病猪的免疫抑制，造成多种病原的混合感染和继发感染，导致更加严重的危害，给养猪业造成巨大的经济损失[25-26]。PCV2全年的发病率均处于较高水平，夏季发病率最高，可能因为广西夏季维持时间长，猪群密度过大，使得畜舍内空气质量差，有害气体不能及时排出，猪只极易引发肺炎等呼吸道疾病，而且猪群在高湿闷热的环境下容易产生应激，使猪群整体免疫力下降，患病率也随之升高。

CSFV单一感染较少，多发生于混合感染，其中与PRRSV和PCV2的混合感染较为常见,本病一年四季均可发生，没有明显的季节性，然而受气候条件等因素影响，广西以冬、秋两季较为严重。PRV和CSFV相似，单一感染率较低，主要以混合感染为主，在寒冷的冬季感染率相对较高，因为低温有利于病毒的存活，病毒主要通过已感染猪排毒而传给健康猪。

Mhp作为猪主要的基础性疫病病原，也是引起猪呼吸道疫病的主要因素之一，2015—2019年间仅检测到4例Mhp的单一感染，其余均为与细菌性病原和病毒性病原的混合感染。当前Mhp常与多种细菌、病毒及环境因素协调作用，引起猪呼吸道综合征(PRDC)。近年来，Mhp与PRRSV常混合感染，使致病性进一步提高，并破坏猪群的免疫功能，从而导致多种疫苗免疫失败。Mhp与PRRSV是引起PRDC的主要病原，在临床感染上存在协同效应，尤其是当这2种病原同时和先后感染猪时，将导致严重的呼吸道症状，病程会很长，病死率也较高[27]。本次调查Mhp检出率偏低，分析可能跟送检样品的采集部位有关，因为部分送检样品未包含Mhp感染靶组织肺的心叶和尖叶。

调查中还发现，除以上4种病毒性病原和Mhp之外，还存在HP和APP等细菌性病原的感染。HP的阳性率为25.31%，除单一感染(5.57%)外，其余均为混合感染，说明细菌性病原也是诱发呼吸道疫病的主要病原；HP的混合感染多与PRRSV和PCV2有关，可能是因为猪感染PRRSV和PCV2等免疫抑制性病原后抵抗力降低，使得HP等细菌性病原极易侵入体内，进而影响猪群健康[28]；HP在冬季发病率较高，冬季气温降低，猪群整体免疫力下降，细菌性病原侵入体内，引起呼吸道疫病。APP是引起猪传染性胸膜肺炎 (PCP)的病原。PCP是一种猪的高度接触性传染性呼吸道疾病，主要表现为暴发性流行，以纤维素性、出血性、坏死性肺炎为特征，一年四季均可发生，但以冬春季节高发,各种年龄的猪均可感染，自然条件下3月龄育肥猪最易感,病猪和亚临床感染带菌猪是本病的主要传染源，可通过猪之间的直接接触或短距离的飞沫传播,是当前导致育肥猪和种猪呼吸道疫病发病和突然死亡的主要原因，已在世界范围内造成了巨大的经济损失。本次调查发现APP检出率较低可能跟送检的样品中以保育猪呼吸道病例居多，而易感性较高的育肥猪呼吸道病例较少有关。

从调查结果来看，广西地区的猪呼吸道疫病感染情况严重且复杂，病原种类多样，混合感染形式复杂，临床上很难区分并作出诊断，应尽早进行实验室检测确诊，针对性实施防控措施，尽可能杜绝或减少误诊漏诊导致的防控偏差，降低经济损失。PRRSV和PCV2是免疫抑制性病毒，是引起猪呼吸道疫病混合感染的主要因素，因此在猪的免疫预防计划中要重点做好这2种疫病的基础免疫，以保护猪免疫功能不受到损害，提高猪只抵抗力，避免受到其他细菌或病毒侵入感染[29-30]。此外，引种问题、生产与饲养管理因素、药物的错误使用等也是造成或加重猪呼吸道疫病感染的重要原因。猪主要呼吸道疫病给养殖户造成巨大的经济损失，严重危害了广西养猪业的持续健康发展。因此，为进一步保障广西养猪业的持续健康发展，需要因地制宜制定科学合理预防策略以有效预防和控制猪呼吸道疫病的暴发和流行：第一，养猪业主应切实做好基础疫苗免疫工作；第二，加强饲养管理，减少高密度饲养和多阶段混养，实施全进全出管理；第三，保证饲养设施及场所的清洁卫生及消毒工作，完善猪场的生物安全体系，做好日常通风、消毒等工作，杜绝外来传染源，切断传播途径；第四，保证不同年龄、不同阶段的猪能够摄入所需营养量，提高免疫功能，降低患病几率；第五，季节变化时期做好猪舍的保温保凉工作，减少猪的应激反应。总之，猪场应根据实际情况制定并落实一套切实可行、科学合理并且长期有效的猪主要呼吸道疫病防治方案，以有效保障猪场的经济效益。

综上，调查发现广西规模猪场呼吸道疫病感染较为严重，7种主要疫病病原均有不同程度的感染，其中PRRSV、PCV2和HP是广西地区猪呼吸道疫病的主要病原。7种猪呼吸道病原多呈混合感染，且感染类型复杂多样，又以PRRSV、PCV2和HP之间的混合感染最为普遍。