杜改梅，孙玫，刘茂军

(1. 金陵科技学院动物科学与技术学院，江苏 南京 210038；2. 江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室，江苏 南京 210014)

羊支原体肺炎是由绵羊肺炎支原体引起的山羊和绵羊最为常见的一种呼吸道疾病，发病率高，死亡率低。羔羊易感性强，发病率和死亡率均较高[1]。感染绵羊肺炎支原体之后，羊只抵抗力降低，容易继发感染其他病原菌，致使病情加重，死亡率升高，该病在世界多个国家地区均有流行，给养殖业造成严重危害[2-3]。羊支原体肺炎的诊断方法较多，如病原分离培养、血清学诊断和分子生物学诊断等[4-6]。但支原体培养条件苛刻，耗时长，不适合应用于临床实际[7]。血清学诊断方法中，ELISA方法特异性强，灵敏度高，高效省时。近年来，我国虽然在该方面的研究报道较多，但目前缺乏稳定成熟的快速、特异、高通量临床应用诊断试剂盒，严重影响了该病的有效诊断与防治工作[8-9]。因此，有效控制羊支原体肺炎，应该建立一种敏感、稳定的诊断方法，这不仅对本病的检测和监控及流行病学调查具有重要意义，而且为疫苗免疫的效果评估提供了支持。

为此，本研究选择绵羊肺炎支原体标准株Y98全菌蛋白为羊支原体肺炎血清学诊断用特异性蛋白抗原，建立间接ELISA抗体检测技术，为羊肺炎支原体特异性诊断试剂盒的研制提供技术基础。

1 材料与方法

1.1 材料

绵羊肺炎支原体标准株Y98由中国农业科学院兰州兽医研究所储岳峰博士惠赠；Y98免疫阳性血清、阴性血清由实验室制备。兔抗山羊酶标二抗购自KPL公司。绵羊肺炎支原体间接血凝试验(IHA)检测试剂盒为中国农业科学院兰州兽医研究所产品。

1.2 方法

1.2.1 间接ELISA反应程序

在包被好的酶标板中加入不同比例稀释的待检血清，100 μL/孔，37 ℃作用一定时间，用洗涤液洗板5次，每次5 min，每孔300 μL。加入一定比例稀释的酶标抗体IgG，100 μL/孔，37 ℃作用一定时间，同上洗涤。加入底物，100 μL/孔，室温避光显色数分钟。加终止液50 μL/孔，终止反应，酶标检测仪测OD450值。

1.2.2 封闭液的确定

在没有包被抗原蛋白的酶标板中，分别用含1%明胶、1% BSA(牛血清白蛋白)、5%牛血清、5%猪血清和5%酪蛋白的磷酸盐缓冲液作为封闭液进行封闭，然后按照1.2.1方法进行ELISA检测，根据OD450值最小时，选出最合适封闭液。将筛选的最佳封闭液稀释为不同浓度，再按照1.2.1方法进行ELISA检测，根据OD450值最小时，选出封闭液的最佳浓度。

1.2.3 抗原最佳稀释度和血清最佳稀释度的确定

采取方阵滴定的方法来确定。取酶标板(8×12)，横排将抗原用包被液按1/200、1/400、1/800、1/1 600进行倍比稀释，每孔100 μL，4 ℃过夜，取出用洗涤液洗涤5次后，每孔加入200 μL 封闭液，37 ℃作用2 h，弃孔内封闭液；竖排将血清按1/25、1/50、1/100和1/200稀释。以阴性OD450值低于0.3，阳性OD450值/阴性OD450值(P/N值)最大的孔所对应的抗原稀释度和血清稀释度为最佳抗原稀释度和血清稀释度。

1.2.4 血清最佳反应时间的确定

加入待检血清后，分别于37 ℃作用45、60和75 min，进行ELISA检测，根据P/N值最大时，确定血清的最佳反应时间。

1.2.5 酶标抗体反应浓度和时间的确定

将酶标抗体进行1/1 000、1/2 000、1/4 000和1/8 000梯度稀释后，37 ℃分别作用30 min，进行ELISA检测，根据P/N值最大时，确定酶标抗体的最佳反应浓度。以最佳浓度分别37 ℃作用45、60和75 min，ELISA检测，根据P/N值最大时，确定酶标抗体的最佳反应时间。

1.2.6 底物反应时间的优化

加入底物后分别作用10、15和20 min，进行ELISA检测，根据P/N值最大时，确定底物的最佳反应时间。

1.2.7 ELISA临界值的确定

采用本研究建立的绵羊肺炎支原体抗体ELISA方法检测22份经绵羊肺炎支原体IHA检测为阴性的血清。计算S/P，进行统计学分析。

S/P=(样品OD450-阴性对照OD450均值)/(阳性对照OD450均值-阴性对照OD450均值)。

1.2.8 临床样品检测符合率研究

用实验室研制的绵羊肺炎支原体血清抗体ELISA检测方法和绵羊肺炎支原体IHA共同检测来自临床的羊血清和绵羊肺炎支原体攻毒试验血清共60份。统计分析阳性符合率和阴性符合率。

1.3 统计分析

所有数据用“平均值±标准误”表示，采用SPSS 11.5统计软件统计，以单因子方差分析(One-way ANOVA)进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 封闭液的筛选优化

分别用含1%明胶、1% BSA、5%牛血清、5%猪血清和5% 酪蛋白的磷酸盐缓冲液作为封闭液，试验结果表明，1% BSA的磷酸盐缓冲液作为封闭液时，OD450值最小，为0.088，效果较好(见图1)。故选择含1% BSA的磷酸盐缓冲液作为封闭液。

图1 封闭液的筛选优化

2.2 抗原和血清最佳稀释度的优化

将抗原蛋白和检测的血清分别进行倍比稀释，采取方阵滴定的方法来检测血清OD450值，选择阴性OD450值小于0.3，且以P/N值最大时的抗原稀释倍数和血清稀释倍数为最佳抗原和血清的稀释倍数，但为了提高ELISA的敏感性，降低血清的非特异反应，同时考虑到临床检测操作的可行性，血清稀释度的选择要较为合理，因此选择抗原最佳稀释度为1/800，血清最佳稀释度为1/50(图2)。

图2 抗原和血清最佳稀释浓度的优化

2.3 血清反应时间的优化

加入待检血清后，分别于37 ℃作用45、60和75 min，进行ELISA检测，结果表明，一抗反应60 min时P/N值最大，表明血清的最佳反应时间为37 ℃ 60 min(图3)。

2.4 HRP-兔抗山羊IgG反应浓度和时间的优化

将HRP-兔抗山羊IgG分别进行1/1 000，1/2 000，1/4 000和1/8 000稀释，37 ℃作用30 min，进行ELISA检测，结果HRP-兔抗山羊IgG作1/4 000稀释，血清P/N值最大，且阴性血清OD450值小于0.3，表明其最佳稀释度为1/4 000(图4a)。在HRP-兔抗山羊IgG作1/4 000稀释后，37 ℃分别作用45、60和75 min，进行ELISA检测，结果反应60 min后P/N值均最大，确定酶标抗体的最佳反应时间为37 ℃ 60 min(图4b)。

图3 血清最佳反应时间的优化

图4 二抗最佳稀释浓度(a)和最佳作用时间(b)的优化

2.5 最佳底物作用时间

加入底物后分别作用10、15和20 min，结果表明阳性血清OD450值在10 min时的P/N值最大，因此选择底物的最佳反应时间为10 min(图5)。

图5 底物最佳作用时间的优化

2.6 间接ELISA临界值的确定

2.7 临床样品检测符合率

用实验室建立的绵羊肺炎支原体抗体ELISA检测方法和绵羊肺炎支原体抗体IHA检测试剂盒共同检测来自临床的羊血清和试验攻毒羊血清共60份。从表1中可以看出，绵羊肺炎支原体抗体ELISA检测方法检出33份阳性，22份阴性，5份可疑；绵羊肺炎支原体IHA检出38份阳性，22份阴性；两者共同检出阳性33份，共同检出阴性20头份。阳性符合率和阴性符合率分别为86.84%和90.90%。

表1 绵羊肺炎支原体抗体ELISA检测方法和IHA检测试剂盒的对比结果

绵羊肺炎支原体抗体IHA检测试剂盒+-总数绵羊肺炎支原体抗体ELISA检测方法+33033-2(另加3个可疑)20(另加可疑2个)22(另加5可疑)总数 382260

3 讨论

羊支原体肺炎是由绵羊肺炎支原体引起的一种以咳嗽、气喘、渐进性消瘦以及肺间质增生性炎症为特征的慢性呼吸道传染病，该病在世界多个国家和地区均普遍流行，给当今养羊业的健康发展造成了严重威胁[10]。该病主要通过空气和飞沫经呼吸道传播，流行性和接触传染性强，可提高羔羊的死亡率，降低成年羊的繁殖性能，并推迟其上市，给养羊业带来巨大经济损失[11-12]。因此，建立快速准确高通量的诊断方法，及时准确地对羊群进行监测，及早发现，对有效防控该病发生起着决定性作用。病原的分离培养是检测绵羊支原体性肺炎的最经典方法，但其方法繁琐、耗时，不适宜向基层推广应用[13]。PCR技术快速，准确性高，绵羊肺炎支原体的PCR方法最低检测限可达到0.01 ng绵羊肺炎支原体DNA[14-16]。但该技术成本高，需要先进的仪器设备，更适宜于实验室研究。环介导等温扩增技术(LAMP)是一种新发现的敏感性高的分子生物学技术，存在假阳性等问题[17]。血清学方法是目前最常用的一种检测技术。赵萍等[10]应用IHA方法检测绵羊支原体肺炎，阳性检出率高，特异性和敏感性高，但其敏感性较ELISA方法低。ELISA方法以其操作简捷方便及良好的检测特异性与敏感性而倍受欢迎，不仅被广泛地应用到科研生产中，也被开发成各种诊断试剂盒广泛应用于临床疾病的检测，在动物疾病的诊断和疫情监测中发挥了重大作用。国内虽开展了大量有关羊肺炎支原体ELISA检测方法的研究[18-19]，但尚无可靠稳定的商品化试剂盒。

ELISA检测方法操作步骤虽简单，但影响因素较多，抗原、封闭液、样品稀释液以及相互之间的作用时间等都会直接影响到检测结果。本研究选取绵羊肺炎支原体Y98标准菌株作为抗原，建立绵羊肺炎支原体的抗体ELISA检测方法。封闭是其中最重要的影响因素之一，是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程，即让不相关的蛋白质充填这些未包被间隙，从而减少ELISA后续步骤中干扰物质的再吸附，其会直接影响ELISA检测方法的敏感度和特异性，导致疾病误诊，造成不良后果。常用封闭液的种类较多，但不同封闭液和不同浓度封闭液的封闭效果均不同。本试验分别用不同种类封闭液进行封闭，结果发现1% BSA封闭效果较好，以含1% BSA、0.05% Tween-20的磷酸盐缓冲液作为稀释液，有效地降低ELISA试验中的非特异性反应，使得结果判定更准确、更明显、更直观。许多报道都以BSA为封闭液，但不同报道所选用的最佳浓度有所不同，这可能与其他诸多因素有关[20]。对包被浓度、血清稀释倍数、酶标二抗反应浓度，以及血清和酶标二抗反应时间进行摸索，并且对各个反应条件进行了优化，建立了绵羊肺炎支原体抗体ELISA检测方法。与IHA检测结果相比，本研究的方法检出33份阳性血清，符合率为86.84%；检出20份阴性血清，符合率为90.90%。这表明该方法特异性好，能够反映绵羊肺炎支原体感染情况，可应用于临床生产中，为羊支原体肺炎提供监测和诊断工具。