徐梦迪，李文倩，杨盛，孙雪婧，陈秋生

(南京农业大学动物医学院，江苏 南京 210095)

鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus，DTMUV)最早在1955年首次从马来西亚库蚊体内分离得到[1]。自2010年春季在我国东南沿海地区暴发，因其传播速度快，发病率高，很快波及其他省份，给我国养鸭业造成了巨大的损失[2]。DTMUV是一种单股正链RNA病毒，归属于黄病毒科，黄病毒属，恩塔亚病毒群。DTMUV与其他致病性黄病毒有着高度的同源性，其基因组长度大约为11 kb，包括1个3′端非编码、1个5′端非编码区和1个中间开放阅读框[3]。研究表明DTMUV不仅可以感染不同品种的鸭，如北京鸭、樱桃谷鸭、金定麻鸭等，还可以引起鹅、鸡、麻雀等禽类发病[4]。该病毒主要导致肉鸭采食量减少，精神沉郁，生长迟缓等；引起产蛋鸭卵巢发炎、出血，卵泡破裂造成产蛋量大幅度下降甚至停产，故又命名为“出血性卵巢炎”[5]。

黄病毒可以通过血液循环造成病毒血症，脾脏位于血液循环通路上，同时研究发现DTMUV感染过程中脾脏是病毒集聚且大量复制的器官之一，是DTMUV主要的靶器官之一[6]。鸭的脾脏具有一定的特殊性，缺乏边缘区，由红髓和白髓构成，于白髓增加了椭球周围淋巴鞘(periellipsoidal lymphatic sheaths，PELS)。血-脾屏障(blood-spleen barrier，BSB)位于白髓，主要由鞘毛细血管、网状细胞、网状纤维以及椭球相关巨噬细胞组成，是脾脏的重要组成部分，能够过滤并呈递血源性抗原，在机体抵抗抗原入侵的过程中起着重要的作用[7]。

凋亡是病毒感染后细胞程序性死亡的一种重要方式[8]。病毒感染诱导细胞凋亡对于机体来说就像一把“双刃剑”，一方面病毒可以通过诱导细胞凋亡将子代病毒释放和传播给宿主，另一方面宿主也可以通过启动细胞凋亡来消灭感染的细胞从而起到防御作用[9]。已研究报道西尼罗河病毒、登革热病毒以及寨卡病毒都可以通过激活死亡受体途径诱导细胞凋亡[10]。但对于DTMUV体内诱导脾脏内细胞凋亡的研究较少，且未见超微形态学方面的报道。

很多病毒感染引起机体病变的严重程度都与患畜的年龄有关，如禽流感病毒[11]、西尼罗河病毒[12]等。DTMUV的感染与发病同样如此，日龄越小的鸭越易感，临床症状也越严重。前人多集中于DTMUV对不同日龄鸭致病性的宏观研究，然而关于感染该病毒对不同日龄鸭BSB及周围组织损伤对比的详细研究未见报道。本试验以7日龄雏鸭与6月龄成年鸭为研究对象，注射相同剂量的DTMUV，通过电镜和光镜技术对DTMUV引起不同日龄鸭BSB及周围组织病理学变化进行详细比较，从形态学的角度为DTMUV侵入机体的免疫机制以及疾病的防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 毒株与试验动物

鸭坦布苏病毒XZ-2012纯化株，由南京农业大学动物传染病诊断与免疫课题组赠与。

7日龄、6月龄健康麻鸭购自南京特给力种植专业合作社，DTMUV阴性鸭用于试验。2个年龄组都分为3组，每组10只麻鸭，其中5只以105TCID50的剂量腿部肌肉注射病毒，其余5只作为对照组注射相同体积的灭菌生理盐水。分别于感染后3、7、11 d(3、7、11 dpi)给试验鸭以25 mg/kg的剂量静脉注射戊巴比妥钠后颈静脉放血处死，迅速采集脾脏，一部分置于4%多聚甲醛溶液用于制作石蜡切片，另一部分修成横截面为1 mm2的长条状固定于4 ℃ 2.5%戊二醛溶液。

1.2 HE染色

取固定好的脾脏制作常规石蜡切片，厚度为6 μm。切片经二甲苯脱蜡后酒精下行入水后，苏木精染色50 s，流水冲5 min，伊红染色5 s，上行脱水后透明，中性树胶封片，用光学显微镜观察切片。

1.3 免疫组化(IHC)

取固定好的脾脏制作常规石蜡切片，厚度6 μm。切片经二甲苯脱蜡后梯度酒精下行至水；3%过氧化氢孵育12 min，蒸馏水洗3次，5 min/次；于枸橼酸钠缓冲溶液中抗原修复，高温加热后煮沸2 min，冷却至室温后0.02 mol/L PBS洗3次，5 min/次；5% BSA 37 ℃封闭30 min；滴加100倍稀释兔抗DTMUV(实验室自制兔多抗)4 ℃过夜；0.02 mol/L PBS洗5次，5 min/次，滴加即用型羊抗兔二抗37 ℃孵育2 h；0.02 mol/L PBS洗5次，5 min/次，DAB显色5 min，蒸馏水洗3次，3 min/次；苏木精复染20 s，流水冲洗5 min，梯度酒精上行脱水，中性树胶封片。

1.4 网状纤维染色

取固定好的脾脏制作常规石蜡切片，厚度10 μm。切片经脱蜡下行入水，1%高锰酸钾水溶液氧化3 min，蒸馏水洗3次，3 min/次；1%草酸水溶液漂白3 min，蒸馏水洗5次，3 min/次；2.5%铁铵矾水溶液媒染14 min，蒸馏水洗5次，3 min/次；银氨水溶液浸银5 min，蒸馏水快速蘸洗3次，再洗3次，3 min/次；10%甲醛水溶液还原2 min，蒸馏水洗3次，3 min/次；0.2%氯化金调色10 s，蒸馏水洗3次，3 min/次；5%硫代硫酸钠水溶液除银沉淀3 min，蒸馏水洗3次，3 min/次；梯度酒精上行至二甲苯透明封片，用光学显微镜观察切片。

1.5 透射电镜样品的制备与观察

取固定于2.5%戊二醛溶液中的脾脏组织，浸入1%四氧化锇溶液中60 min，乙醇溶液梯度脱水后用Epon812包埋。制作超薄切片后用柠檬酸铅和醋酸铀染色20 min，切片用日立Hitach-7650透射电镜进行观察。

1.6 数据分析

切片的半定量分析用Image-Proplus 6.0测量积分光密度值(IOD)值，用IBM SPSS Statistics 20分析数据，采用t检验分析，P<0.05为显著性差异，用GraphPad Prism 5.0作图。数值用“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 感染DTMUV不同日龄鸭BSB及周围组织病理学变化差异

6月龄对照组鸭脾脏红、白髓界限清晰，椭球和PELS发育完善(图1b)。7日龄鸭脾脏椭球直径和PELS的体积比6月龄鸭小(图1a)。随着日龄增加，7日龄鸭3～7 dpi对照组椭球直径和PELS体积增加，脾脏结构不断发育(图1c～图1e)。6月龄鸭脾脏已发育成熟，感染后，对照组鸭脾脏组织结构无明显变化。3 dpi，2个年龄组鸭脾脏红、白髓界限模糊，7日龄鸭脾脏椭球、PELS结构难辨，较多细胞坏死，细胞数量明显减少(图1f)；而6月龄鸭脾脏椭球和PELS内少量细胞坏死(图1i)。7 dpi，7日龄鸭脾脏椭球周围仍有空泡变性现象(图1g)；而6月龄鸭脾脏组织结构已开始恢复，但椭球和PELS结构不清晰(图1j)。11 dpi，7日龄鸭脾脏椭球和PELS结构仍不清晰(图1h)；而6月龄鸭脾脏红、白髓明显，椭球和PELS基本恢复正常(图1k)。

RP.红髓；E.椭球；SC.鞘毛细血管；→.细胞坏死；▲.空泡变性；标尺=20 μm

2.2 不同日龄鸭脾脏内DTMUV的分布比较

7日龄、6月龄鸭对照组DTMUV呈阴性(图2a和2b)。3 dpi，脾脏内病毒都集中于椭球外围和PELS，但7日龄鸭脾脏内病毒的分布与阳性反应都强于6月龄鸭(图2c和2d)。7 dpi，7日龄鸭脾脏病毒阳性除分布于红髓，在椭球外围和PELS仍有阳性分布(图2e)；而6月龄鸭脾脏内病毒阳性主要分布于红髓(图2f)。11 dpi，7日龄鸭脾脏红髓和PELS仍有病毒阳性分布，且强于6月龄鸭(图2g)；而6月龄鸭脾脏红髓仅出现较弱病毒阳性(图2h)。脾脏内DTMUV的半定量结果如图3，在3～11 dpi，7日龄鸭脾脏内DTMUV阳性都显著强于6月龄鸭(P<0.05)。

RP.红髓；SC.鞘毛细血管；→.DTMUV阳性；标尺=20 μm(a，b，e，f，g，h)，标尺=10 μm(c，d)

图2 不同日龄鸭脾脏内DTMUV的分布比较(IHC)

2.3 感染DTMUV对不同日龄鸭BSB网状纤维损伤的比较

6月龄对照组鸭BSB网状纤维主要分布于鞘毛细血管基膜、椭球、PELS和PELS与红髓交界处；而7日龄鸭BSB椭球壁与6月龄相比略不发达，PELS与红髓交界处网状纤维未形成(图4a和4b)。随着日龄增加，7日龄鸭3～7 dpi对照组BSB网状纤维不断增加(图4c～图4e)。7 dpi，对照组鸭脾脏PELS与红髓交界处网状纤维形成(图4d)。6月龄鸭脾脏已发育成熟，感染后，对照组鸭BSB网状纤维分布无明显变化。3 dpi，7日龄BSB网状纤维损害严重，椭球壁、PELS内网状纤维大量减少甚至消失(图4f)；而6月龄鸭脾脏椭球壁和PELS内网状纤维遭到轻微破坏，PELS与红髓交界处网状纤维破坏消失(图4i)。7 dpi，2个年龄组鸭BSB网状纤维都增多，但7日龄鸭BSB网状纤维排列更紊乱(图4g和4j)。11 dpi，7日龄鸭BSB网状纤维仍较多，排列略紊乱，且PELS与红髓交界处网状纤维仍未形成(图4h)；而6月龄鸭BSB网状纤维基本恢复正常(图4k)。感染DTMUV鸭BSB网状纤维的半定量结果如图5，在3～7 dpi，7日龄鸭BSB网状纤维的相对含量显著低于6月龄鸭；在11 dpi，7日龄鸭BSB网状纤维的相对含量显著高于6月龄鸭(P<0.05)。

不同天数组间比较，不同字母表示差异显著(P<0.05)，字母相同表示差异不显著(P>0.05)。下同

图3 脾脏内DTMUV的IOD值

2.4 DTMUV对不同日龄鸭脾脏内细胞超微结构破坏的比较

对照组7日龄、6月龄鸭脾脏内细胞形态完整(图6a和6b)。3 dpi，7日龄鸭脾脏内大部分细胞核膜严重皱缩，细胞质空泡化，内质网肿胀、线粒体嵴断裂、消失(图6c)；6月龄鸭脾脏内大部分细胞核膜完整，部分细胞核膜轻度皱缩，内质网、线粒体肿胀，线粒体嵴断裂甚至消失(图6d)，相比而言7日龄鸭脾脏内细胞病变更严重。7 dpi，2个年龄组鸭脾脏内细胞都出现染色质聚集，细胞核固缩或崩解呈“月牙形”，为典型的细胞凋亡现象(图6e和6f)。11 dpi，7日龄鸭脾脏内仍有细胞内有脂质(图6g)，而6月龄鸭脾内脏细胞结构形态基本恢复正常(图6h)。

RP.红髓；SC.鞘毛细血管；→.PELS与红髓交界处网状纤维，红色剪头表示有网状纤维，绿色表示没有网状纤维；▲.椭球壁；标尺=20 μm

图4 感染DTMUV对不同日龄鸭BSB网状纤维损伤的比较(网状纤维染色)

图5 感染DTMUV鸭BSB网状纤维相对IOD值

3 讨论

通过对照组HE、网状纤维染色结果发现，与6月龄鸭相比7日龄鸭脾脏椭球直径小，PELS体积小，椭球壁、PELS与红髓交界处网状纤维发育不完善，表明7日龄鸭脾脏和BSB都未发育成熟。本试验以BSB发育不成熟的7日龄鸭与BSB发育成熟的6月龄鸭为研究对象，结果发现DTMUV感染雏鸭脾脏病变更严重，致病性更强，说明BSB可能对病毒有一定的阻挡能力。

脾脏是机体最大的外周免疫器官，在过滤、抵抗病原微生物入侵中起着重要的作用，而这些主要依赖于BSB[7]。结合HE与IHC结果发现：3 dpi时，7日龄鸭脾脏椭球、PELS内细胞坏死及病毒阳性分布明显比6月龄鸭严重。因7日龄鸭脾脏未发育成熟，免疫功能不完善，对病毒的抵抗力弱，组织病变更严重。有研究报道DTMUV感染时脾脏是最早发病的器官，感染6 d后开始有一定的恢复[13]。本试验7～11 dpi，6月龄鸭脾脏结构逐渐恢复，病毒阳性不断减弱，但7日龄鸭脾脏在7 dpi时仍有空泡变性现象，病毒阳性减弱较慢。实验室前期研究发现，DTMUV主要感染椭球外围PELS内淋巴细胞和巨噬细胞[14]。我们认为由于7日龄鸭脾脏和BSB未发育成熟，过滤和呈递抗原的功能不完善，清除病毒的速度慢且病毒造成的损伤持久。

ER.内质网；Mi.线粒体；直箭头.核膜皱缩；弯箭头.染色质凝集；▲.脂质；标尺=4 μm(b，c，e，f，h)；标尺=6 μm(a，d，g)

图6 DTMUV对不同日龄鸭脾脏超微结构破坏的比较

网状纤维是BSB的网络支架，在淋巴细胞迁移[15-16]以及机械性抵抗外源物质的过程中有着重要的作用[17]。网状纤维的增加、减少以及排列方式的改变都有一定临床诊断意义[18]。本试验结果表明：3 dpi时，2个年龄组鸭BSB网状纤维都减少，7日龄鸭脾BSB网状纤维损伤更严重。Weiss等[19]研究发现疟原虫感染小鼠后，网状细胞被激活并通过增加其分支来保护机体免受寄生虫危害。7 dpi时，2个年龄组鸭BSB的网状纤维都增加，但排列紊乱。此时网状纤维增加可保护机体，同时可能有利于淋巴细胞的迁移和归巢，促进脾脏的恢复。11 dpi时，6月龄鸭BSB网状纤维基本恢复正常结构，但7日龄鸭BSB网状纤维仍然较多排列略紊乱。再次表明感染前期，雏鸭由于BSB发育不成熟，网状纤维支架遭到的破坏严重，也影响感染后期脾脏和BSB的恢复速度。11 dpi时，7日龄鸭脾脏PELS与红髓交界处网状纤维仍未形成，这表明DTMUV阻碍了BSB的正常发育。

细胞水肿是一种可复性损伤，主要表现为线粒体、内质网肿胀，但水肿严重会造成细胞死亡。电镜结果发现3 dpi，2个年龄组鸭脾脏内细胞水肿，但7日龄鸭脾脏内核膜明显皱缩。可见DTMUV引起雏鸭脾脏内细胞水肿程度严重，这可能是导致雏鸭脾脏内细胞死亡较多的原因之一。凋亡是一种病毒诱导所引起的细胞死亡方式，机体在遭到病毒入侵时，凋亡很可能是细胞的一种自我防御手段。本试验在7 dpi时，2组鸭脾脏内细胞都出现典型的凋亡现象。我们推测此时脾脏内细胞通过凋亡的方式清除病毒来达到保护机体的作用。细胞凋亡有3条信号通路，分别是线粒体通路，内质网通路和死亡受体通路，对于DTMUV通过哪条信号通路诱导凋亡需要进一步研究。11 dpi时，7日龄鸭脾脏内仍有细胞内残存脂质，脂质的异常会影响细胞的正常生命活动，说明7日龄鸭脾脏仍未恢复。

综上所述，与6月龄成年鸭相比，7日龄雏鸭脾脏和BSB未发育成熟，DTMUV对BSB及周围组织的破坏更严重，脾脏和BSB排除病毒和恢复也较慢。同时DTMUV诱导鸭脾脏内细胞凋亡，为DTMUV的发病与防御机制的研究提供思路。