武晓英，刘地，曹贵东，李博，李娜，吴丽华，乔宏萍*

(1. 太原师范学院生物系，山西 晋中 030619；2. 山西瑞象生物药业有限公司，山西 太原 030032)

硒是动物正常生长和繁殖所必需的微量元素，在机体内发挥着极其重要的生物学功能[1]。已有研究表明，硒是公畜精子生存和发育必需的微量元素[2]。动物缺乏硒，会影响公畜生殖器官的发育和生殖细胞的形成，导致繁殖机能障碍[3]。因此缺硒被认为是引起精子质量下降的原因之一[4]。如添加适量的硒，可明显改善精子活力和活动精子百分率，并降低精子畸形率，提高后代的繁殖性能[5]。而且研究发现，硒能通过调节细胞活性氧自由簇(ROS)的产生来调控细胞凋亡，硒的缺乏更容易导致ROS的产生，使组织发生脂质过氧化反应并引起细胞凋亡，补硒可以防止睾丸组织脂质过氧化物的产生[2,6]。本试验通过在哺乳期母羊日粮中添加纳米硒，研究硒元素通过母乳向后代羔羊转移的情况，以及对后代生殖系统睾丸发育的影响，为提高后代羔羊的繁殖性能提供可靠的试验依据。

1 材料与方法

1.1 饲养试验

1.1.1 试验地点概况

试验地点：山西省忻州地区西南部的岢岚县，为我国典型的缺硒地区(0.03～0.06 mg/kg)。

1.1.2 试验动物、试验设计与日粮配制

本试验时间为120 d，选择体重相近，产单胎公羔的母羊12只，从母羊产羔至羔羊断奶期间，随机分为2组，每组6只，一组母羊饲喂基础日粮，为对照组(C组)；另一组在基础日粮的基础上添加0.5 mg/kg的Nano-Se(上海四通纳米技术港有限公司)，为试验组(S组)。母羊的基础日粮参照NRC (2007) 哺乳期绒用山羊的饲养标准配制而成，组成见表1。分组的母羊分栏饲喂，定时定点放牧。

1.2 主要试剂与仪器

抗氧化力谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；TaKaRa TRIzol Reagent、TaKaRa RT Reagent Kit和TaKaRa SYBR PremixExTaqTM试剂盒购自大连宝生物工程有限公司(TaKaRa)。

表1 基础日粮配方与主要营养成分

日粮组成 含量/%营养成分2含量玉米 大豆秸秆 葵花饼 麸皮 食盐 磷酸钙 预混料1 苜蓿 玉米秸秆 大豆粉 18.0414.553.842.20.60.50.430.0025.274.59粗蛋白/% 消化能/(MJ·kg-1)钙/%磷/%硒/(MJ·kg-1)酸性洗涤纤维/%中性洗涤纤维/%10.089.640.750.30.0432.0946.53

注：1每千克日粮中含量：FeSO4·7H2O 20 mg; MnSO4·H2O 18 mg; ZnSO4·7H2O 45 mg; CuSO4·5H2O 25 mg; CoCl2·6H2O 0.2 mg; KI 1.2 mg 维生素A 2 000 U(或600 μg); 维生素D 500 U(或12.5 μg); 维生素E 225 U(或150.3 mg)。2除消化能为计算值外，其他全部为实测值。

2100型可见光分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司UNIC)；CX43奥林巴斯显微镜(日本Olympus)；RM2235徕卡组织切片机(德国Leica)；SK-2003A原子荧光光度计(上海精密仪器仪表有限公司)；NanoDrop2000超微量分光光度计(美国Thermo)；ABI QuantStudio荧光定量PCR扩增仪(美国ABI)。

1.3 样品采集

母乳和血样采集：羔羊出生后12 h内采集母羊初乳，在羔羊断奶之前，采集母羊与羔羊的血液，同时析出血清，分装于1.5 mL离心管中，置-70 ℃保存待测。

组织样的采集：在羔羊120 d断奶后，迅速屠宰母羊取母羊的肝、肾、心等组织，并同时采集羔羊的肝、肾、心和睾丸组织样，将从妊娠母羊及胎儿所取的组织样本迅速投放入液氮中用于生化检测。

1.4 硒含量测定

取血样和组织样用浓硫酸完全消化，加入双氧水加热至溶液清亮无色，定容后采用原子荧光光度计进行检测。

1.5 抗氧化能力测定

羔羊睾丸组织中的GSH-Px活性采用DTNB法试剂盒检测(批号：20180604)；SOD活性采用黄嘌呤氧化酶法试剂盒检测(批号：20180604)；MDA含量采用硫代巴比妥酸比色法试剂盒检测(批号：20180604)。所有测定过程严格按照南京建成生物工程研究所试剂盒中的操作指南进行。

1.6 睾丸组织TUNEL检测和精子形态学观察

制备睾丸组织的石蜡包埋切片，利用TUNEL试剂盒(批号：20180626)中的地高辛标记凋亡细胞DNA的3′ -OH末端，再结合链酶亲和素-过氧化物酶(SABC)，最后加入二氨基联苯胺(DAB)显色，并于显微镜下观察细胞凋亡情况。每个个体在显微镜下取至少5个视野进行拍照，使用Image Pro Plus 6.0图像分析软件进行分析，得出每个视野中的阳性细胞数。

收集附睾中的精液，经离心获取精子，稀释至适当浓度后采用巴氏染色法进行染色观察，每个样品连续计数200个精子。

1.7 睾丸组织凋亡基因检测

1.7.1 总RNA提取和cDNA合成

按照TaKaRa TRIzol Reagent试剂盒(批号：20180612)操作说明，分别提取每组6只120日龄羔羊睾丸组织的总RNA，焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水溶解，紫外分光光度计测定总RNA的浓度和纯度，调整浓度至1 μg/μL左右，-80 ℃保存。

按照TaKaRa RT Reagent Kit试剂盒(批号：20180615)操作说明，用随机引物对总RNA进行反转录，转录获取的cDNA于-20 ℃保存。

1.7.2 引物设计及合成

利用Primer 5.0的引物设计软件，根据Genebank登录的B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、促凋亡基因(Bax)和 GAPDH的cDNA序列，设计表2的上下游引物，引物由上海生工生物工程公司合成。

表2 实时荧光定量所用引物序列

基因引物(5' →3' )基因序列号引物长度/bpBcl-2F: GATGACCGAGTATCTGAACCG R: GACAGCCAGGAGAAATCAAACANM_001166486120BaxF: TCGGTCTCAACGGCTACA R: CCACTCCAGCCACAAAGANM_173894189GAPDHF: GGTGATGCTGGTGCTGAGR: TGACAATCTTGAGGGTGTTGNM_173894181

1.7.3 定量标准曲线的绘制和Real-time PCR

不同组织总RNA提取纯化后，测定浓度，并将其稀释到1 μg/μL,作为标准曲线中浓度最高的模板，然后将其依次10×稀释7个梯度，控制所有要检测的mRNA浓度在此梯度稀释浓度范围内，用于标准曲线的制作。

根据TaKaRa SYBR PremixExTaqTM试剂盒(批号：20180615)建议反应条件构建二步PCR循环反应体系，选用GAPDH基因做为内参，每个样本重复3次，根据标准曲线以及荧光曲线Ct值计算定量结果。

1.8 数据分析

试验数据用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析，并进行F检验和Duncan多重比较。试验组与对照组之间的差异显著用字母表示，大写字母不同代表差异极其显著(P<0.01)，小写字母不同代表差异显著(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 母源纳米硒对母乳、母羊和羔羊血液中硒含量的影响

表3结果显示，哺乳母羊日粮中纳米硒的添加极显著提高了S组母羊初乳和常乳中硒的含量(P<0.01)，同时极显著提高了母羊与羔羊血液中硒的含量(P<0.01)。同一组别血液与母乳硒含量比较显示，C组母羊血液中硒含量显著高于初乳(P<0.05)，且母羊血硒>初乳>羔羊血硒>常乳。S组母羊初乳中硒的含量极显著高于母羊和羔羊血液、母羊常乳中硒的含量(P<0.01)，S组中硒含量高低比较为初乳>母羊血硒>羔羊血硒>常乳。

2.2 母源纳米硒对母羊和羔羊不同组织中硒含量的影响

由表4可知，哺乳母羊日粮中加入纳米硒，母羊和羔羊组织中硒的含量S组都极显著高于C组(P<0.01)；比较同一组别母羊与羔羊相同组织中硒的含量，母羊组织硒含量显著高于羔羊(P<0.05)；C组与S组母羊组织中硒的沉积顺序是肾脏>肝脏>心肌，C组羔羊组织中硒的沉积顺序是肾脏>肝脏≈睾丸>心肌，S组羔羊组织中硒的沉积顺序是睾丸>肾脏>肝脏>心肌。

表3 母源纳米硒对母乳、血硒含量的影响(n=6) μg·mL-1

组别母乳硒含量血液硒含量初乳常乳母羊羔羊C0.12±0.02B0.04±0.01B**0.15±0.02B*0.08±0.01B* S0.92±0.03A0.34±0.07A**0.76±0.03A**0.57±0.02A**

注：同列数据肩标大写字母不同表示差异极显著(P<0.01)。同行数据和初乳比较，*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)。

表4 母源纳米硒对母羊与羔羊组织硒含量的影响(n=6) μg·g-1

组织羔羊母羊C组S组C组S组肝0.20±0.02B0.42±0.03A0.24±0.01B*0.48±0.04A*肾0.25±0.01B0.51±0.04A0.31±0.01B*0.65±0.03A*心0.17±0.01B0.32±0.01A0.22±0.03B*0.35±0.02A*睾丸0.21±0.04B0.76±0.04A

注：同行数据组间比较，肩标大写字母不同表示差异极显著(P<0.01)。同行羔羊与母羊组内比较，肩标*表示差异显著(P<0.05)。

2.3 母源纳米硒对羔羊睾丸组织抗氧化性能的影响

由表5可知，哺乳母羊日粮中加入纳米硒，S组羔羊睾丸组织中SOD的活性显著提高(P<0.05)，GSH-Px的活性极显著提高(P<0.01)，MDA的浓度极显著降低(P<0.01)。

表5 母源纳米硒对羔羊睾丸组织抗氧化性能的影响

组别SOD/(U·mg-1)GSH-Px/(U·mg-1)MDA/(nmol·mg-1)C51.24±8.02b98.41±5.01B7.31±0.21AS83.25±10.03a164.58±11.07A2.18±0.42B

注：同列数据组间比较，大写字母不同表示差异极其显著(P<0.01)，小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。下同

2.4 母源纳米硒对羔羊睾丸组织发育的影响

表6结果显示，哺乳母羊日粮中添加纳米硒，羔羊睾丸组织的重量极显著增加(P<0.01)，睾丸长度和睾丸周径显著增长(P<0.05)。

表6 母源纳米硒对羔羊睾丸组织发育的影响(n=6)

组别睾丸重量/g睾丸长度/cm睾丸周径/cmC43.23±3.54B7.02±1.02b9.34±0.88bS65.12±6.23A8.97±0.97a12.18±1.03a

2.5 母源纳米硒对睾丸组织细胞凋亡和精子形态的影响

图1结果显示，哺乳期母羊日粮中添加纳米硒，硒通过母乳向羔羊传递，S组羔羊睾丸组织细胞凋亡数量极显著降低(P<0.01)。

由表7结果可知，C组和S组羔羊精子中都没有完全缺陷型精子，缺硒C组羔羊精子畸形率极显著高于补硒的S组(P<0.01)。

Sz.精子；Sg.精原细胞；PS.初级精母细胞；IC.睾丸间质细胞

组间大写字母不同表示差异极显著(P<0.01)，小写字母不同表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)。下同

图1 母源纳米硒对羔羊睾丸组织细胞凋亡的影响

表7 母源纳米硒对羔羊精子形态的影响(n=6)

组别正常头部缺陷颈部和中段缺陷尾部缺陷完全缺陷总数精子畸形率/%C67.52±3.52A32.21±2.76A64.47±5.63A35.62±3.41A020066.31±3.24AS149.14±9.78B10.16±1.21B32.54±3.22B8.43±1.34B020032.16±1.57B

2.6 母源纳米硒对睾丸组织凋亡基因表达的影响

图2 母源硒对睾丸组织中Bax和Bcl-1基因表达的影响

3 讨论

3.1 母源硒对母羊血乳屏障硒传递的影响

营养物质可以通过胎盘和母乳由母体向后代进行转移[7]。妊娠期胎盘作为母体和胎儿之间物质转运纽带，使硒在胎盘转运过程中优先供给胎儿，导致胎儿血液中硒的含量明显高于母体[8]；而在哺乳期，乳汁又成为转移营养物质的主要载体，动物血液、组织和乳汁中的硒含量会受到日粮中硒含量的影响，研究发现妊娠母牛血液中硒的含量与其所产小牛的硒含量存在正相关[9]。本试验纳米硒组母羊初乳和常乳以及母羊和羔羊血液中硒含量提高与前人结果一致，说明硒可以通过血乳屏障进行转运。但同时试验结果显示硒的转运具有选择性，在缺硒的C组，母羊血硒含量高于初乳中硒的含量，考虑哺乳母羊优先满足自身对硒的需求；补硒的S组，母羊初乳中硒的含量高于母羊血硒含量。初乳是提高后代免疫力的重要因素，鲜有人报道初乳中硒的含量与血乳屏障的选择性转运有关[7]。本试验证实，在哺乳期母羊日粮中补充适量纳米硒可以促进硒优先转运进入初乳中。本试验目的是研究硒对后代生殖发育的影响，因此初乳中硒含量增高对后代机体免疫力的影响还有待进一步研究证实。

3.2 母源硒对组织硒沉积和羔羊睾丸组织发育的影响

硒元素是生物机体必需的微量元素，严重缺硒可以引起畜禽的大规模死亡[10]。硒可以沉积在不同的组织器官中，但在含量分布上有一定差异，已有报道，雄性动物睾丸组织中硒的含量较高[11]。郭云霞等[12]在柴鸡饲喂酵母硒的研究中发现，组织中硒的沉积顺序是肾脏>肝脏>肌肉。在本试验中，C组与S组母羊组织中硒的沉积顺序均与此一致；而羔羊硒的沉积在2组中不一致，睾丸组织在C组中并没有表现出明显的沉积优势，考虑当地虽处于缺硒地带，缺硒尚未引起畜禽的大规模死亡，但繁殖力较低，这可能与与雄性动物睾丸组织缺硒有关。已有许多研究表明，雄性动物睾丸的发育与硒紧密相关，硒对雄性生殖器官的发育和精子活力都有显著影响[4,13]。当动物缺硒时，睾丸和附睾的重量减轻[14]。我们的研究结果同样显示哺乳母羊日粮缺硒会直接影响后代羔羊睾丸组织的发育和精子的形态。

3.3 母源硒对羔羊睾丸组织抗氧化性能及细胞凋亡的影响

硒是体内许多酶的活性中心组成成分[1]，可清除ROS[2,6]，减少脂质过氧化物(LPO)的产生[15]，保护脏器及组织免遭氧化损伤[16]。硒是GSH-Px的活性中心组成成分，组织中GSH-Px能保护细胞膜的结构免受过氧化损伤，减少脂质过氧化物MDA在体内的积蓄。SOD也能够清除体内的自由基并阻断LPO的链式反应。该试验中cGPX、SOD和MDA的含量变化，表明哺乳母羊日粮中纳米硒的添加提高了羔羊睾丸组织的抗氧化力，降低了脂质过氧化物的产生。

细胞在体内酶系统和非酶系统的作用下维持体内氧化平衡，一旦平衡被破坏，细胞内的核酸会遭受氧化损伤[17]。研究发现，硒能通过调节细胞的DNA损伤和ROS的产生调控细胞凋亡[18]。本试验中哺乳母羊日粮中缺硒导致后代羔羊睾丸组织中精原细胞、初级精母细胞和间质细胞的凋亡，而S组中仅精原细胞发生凋亡，提示睾丸组织的凋亡首先从精原细胞开始。

目前，Bcl-2基因家族是研究比较多的凋亡相关基因[19]。其中Bcl-2具有抑制细胞凋亡的作用，Bax是促凋亡基因。本试验中C组Bax表达的升高，与TUNEL法检测睾丸组织细胞凋亡结果一致。

综上所述，母源硒通过母乳传递给后代公羔，不但提高了羔羊血液和组织中硒的含量和抗氧化力，而且睾丸组织有明显的硒沉积优势。硒的添加降低了后代睾丸组织细胞凋亡，促进睾丸组织发育，降低了精子畸形率。