李笑峰 张玲秀 赵二劳

(1.忻州师范学院化学系，山西 忻州 034000;2.忻州师范学院生物系，山西 忻州 034000)

纤维素能够转化为乙醇、可溶性糖以及一些其它工业化合物等可利用物[1]，而利用纤维素酶水解纤维素实现其转化是一条环保、高效、无污染的有效途径[2]。在酒精发酵时添加纤维素酶可显著提高酒精或白酒生产中的原料利用率[3]，利用纤维素酶分解农作物秸秆可充分、有效利用农作物秸秆。因此，纤维素酶的生产对人类社会发展具有重要的意义。但纤维素酶生产周期长、成本相对较高，且产率和活力相对较低，所以其工业化应用受到限制[4]。因此，选育产生纤维素酶的新菌种，从而降低成本、提高纤维素酶产量和活力受到广泛关注[5]。粗糙脉孢菌能够合成纤维素酶、半纤维素酶和木质素酶，同时可避免由纤维二糖积累引起的反馈抑制[6]。本研究在前期对粗糙脉孢菌产纤维素酶工艺优化研究[5]的基础上，进一步研究温度、pH及金属离子Zn2+、Mg2+、K+和Cu2+等对所产纤维素酶活力的影响，为深入研究粗糙脉孢菌产纤维素酶的机制及其工业化应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

材料与试剂：粗糙脉孢菌(NeurosporacrassaQF)(实验室保存)，酒石酸钾钠，3,5-二硝基水杨酸，Sephadex G-75，葡萄糖，磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙、七水硫酸铁和七水硫酸锌等，均为国产分析纯，蛋白胨、酵母浸粉和麦芽糖等为国产生化试剂。

仪器：UV-2102C型紫外分光光度计(尤尼柯上海仪器有限公司), PHSJ-5型pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司), HC-3018高速冷冻离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司),FA2004N电子天平(上海箐海仪器有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1菌种活化

保存菌种连续转接PDA试管斜面活化三次。

1.2.2葡萄糖标准曲线的绘制

采用DNS法，并参考文献[5]的方法绘制。

1.2.3粗酶液的制备

在250 mL的锥形瓶中装入80 mL产酶培养基，接入5%菌种，在28 ℃、150 r/min的摇床中培养5天。取培养液于4 ℃高速离心10分钟，上清液即为粗酶液。

1.2.4盐析

按60%、70%和90%不同硫酸铵饱和度进行分级沉淀，根据纯化结果，分析比较出最佳硫酸铵液饱和度。

1.2.5层析

试验采取Sephadex G-75分子筛层析技术对酶进行进一步的分离纯化。

1.2.6纤维素酶活力的测定

在酶催化下，每1 mL酶1 min产生0.01 mg葡萄糖定义为一个酶活单位。取层析后酶液1.0 mL，再加入1 cm×1 cm的滤纸片，加入0.5 mL pH4.8醋酸缓冲液，反应30 min后，加入DNS溶液2 .0 mL，摇匀后沸水浴5 min，以10000 r/min 离心5 min，取上清液在波长550 nm处测定吸光值。

1.2.7温度对酶活力的影响

分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃下测定纤维素酶活力，研究温度对酶活力的影响。

1.2.8pH对酶活力的影响

分别在pH 4.0、4.4、4.8、5.2、5.6条件下，测定纤维素酶活力，研究pH对酶活力的影响。

1.2.9金属离子Zn2+、Mg2+、Cu2+和K+离子浓度对酶活力的影响

酶反应系统中调整各离子浓度分别为0.0 mg/mL、0.004 mg/mL、0.04 mg/mL、0.08 mg/mL、0.12 mg/mL、0.16 mg/mL、0.20 mg/mL，测定不同离子浓度下纤维素酶活力，研究离子及其浓度对酶活力的影响。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线

以葡萄糖浓度为横坐标，其吸光度值为纵坐标，绘制葡萄糖标准工作曲线如图1。求得工作曲线方程为：A=0.504C-0.039 1，相关系数R2=0.994 0。可知，在葡萄糖质量浓度为0.2～1.2 mg/mL的范围内，线性关系良好。

图1 葡萄糖标准曲线Fig. 1 Standard curve glucose

2.2 盐析和层析结果

测定不同饱和度的硫酸铵溶液分别沉淀粗糙脉孢菌所产胞外纤维素酶的活力，结果如图2所示。由图可知，70%饱和度硫酸铵溶液所得纤维素酶活力最高。

图2 不同硫酸铵饱和度沉淀纤维素酶的活力Fig. 2 Activity of cellulase precipitated by different ammonium sulfate saturation

为了检测所获酶纯度，将上述步骤获得的纤维素酶，进行透析脱盐后再通过Sephadex G-75层析，如图3所示其纯度较好，重新收集40 min～87 min的收集液，再经无水乙醇沉淀即获得较纯纤维素蛋白酶。

图3 70%饱和度硫酸铵沉淀蛋白层析效果Fig. 3 Result of the chromatography of protein precipitated by ammonium sulfate at 70% saturation

2.3 温度对纤维素酶活力的影响

分别选取30℃、40℃、50℃、60℃、70℃进行酶的活力测定，研究温度对所产纤维素酶活力的影响，结果如图4。可见温度为50℃时，所产纤维素酶活力最强，与其他温度相比有显著差异(P< 0.05)。

图4 温度对纤维素酶活力的影响Fig. 4 Effect of temperature on cellulase activity

2.4 pH对纤维素酶活力的影响

酶的催化活力与环境pH有关，在pH分别为4、4.4、4.8、5.2和5.6时，测其酶的活力，结果如图5。

图5 pH对纤维素酶活力的影响Fig. 5 Effect of pH on cellulase activity

由图5可知，随着pH值的上升，纤维素酶活力呈先升后降趋势，pH为4.8时，纤维素酶的活力最高。

2.5 金属离子对纤维素酶活力的影响

测定金属离子Zn2+、Mg2+、Cu2+和K+对纤维素酶活力的影响如表1。由表1可知，Zn2+、Mg2+和Cu2+对所产纤维素酶活力具有一定的抑制作用，且有剂量效应。K+对纤维素酶活力具有一定的激活作用，在0.16 mg/mL时激活作用最强。一般来说，金属离子对纤维素酶活力的影响有两种作用，即激活和抑制，原因可能是通过配位机理稳定过渡态或引起pKa改变，对酶活力的促进作用也可能是因为其与酶活性中心结合后更易于纤维素的结合，增强水解效果，发挥了协助功能[7]。

表1 金属离子对纤维素酶活力的影响

3 讨论

我国作为一个农业大国，农作物秸秆极为丰富，但由于处理费用高且经济效益差，往往不能很好的利用。每年春季，农田中焚烧秸秆造成严重的空气污染。为了解决这一问题，国内外目前采用首先将秸杆前期处理，即通过化学、物理、酶、微生物发酵等方法将其降解为次级产品，再经酵母发酵最终生产乙醇等产品。其中秸秆前期处理首选酶法，因为其具有工业化程度高，降解效率高等优点，但是酶相对价格较高、稳定性差，导致生产成本较高，制约了其的推广应用。研究价廉高效的纤维素酶生产成为人们极感兴趣的课题。

本实验以一株粗糙脉孢菌为材料，其所产纤维素酶活力高于里氏木酶，具有一定的应用潜能。通过对所产纤维素酶催化条件分析，以期提高其活力，降低其生产成本。

4 结论

经硫酸铵分级盐析，葡聚糖凝胶层析纯化的粗糙脉孢菌所产纤维素酶，在温度50℃、pH 4.8条件下，活力最高。Zn2+、Mg2+和 Cu2+抑制所产纤维素酶活力，K+可激活所产纤维素酶活力。