杨 贺 张 楠 刘自广 林建辉 孙世臣 刘圣怡 岑 曦 吴 娟*

(1.东北盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室，生命科学学院，东北林业大学，哈尔滨 150040； 2.黑龙江省农业科学院畜牧研究所，哈尔滨 150028； 3.黑龙江省农业科学院耕作栽培研究所，哈尔滨 150028； 4.牡丹江医学院，牡丹江 157011)

非编码RNA(non-coding RNA,nc RNA)指不翻译成蛋白质的多种RNA(包括rRNA，tRNA，snoRNA，microRNA等)。研究表明非编码RNA广泛存在于生物体中，其中人类基因组约2%转录本具有编码蛋白质的功能，其余大部分转录本是非编码RNA。它们可由基因组上任意位点转录生成[1～3]，通过调节靶基因表达，在胚胎发育、肿瘤发生等过程中发挥重要生物学功能。

非编码RNA根据序列长度可分为两种，小于200个核苷酸长度为短非编码RNA(small no-coding RNA)，包括siRNA、sdRNA、piRNA等。大于200个核苷酸长度为长非编码RNA(long no-coding RNA,lncRNA)。迄今为止，发现的长非编码RNA约有15 000种[4]，大多数由RNA聚合酶Ⅱ转录而来，具有5′帽、poly(A)尾及选择性剪接位点等结构。研究证实，lncRNA来源于编码蛋白质基因开放阅读框的更改；染色质重组；非编码序列的反转录转座；局部复制子的串联；转座元件的插入[5]，并参与了蛋白质编码基因的转录前水平调控、转录后水平调控、翻译水平调控、表观水平调控等多个转录调控阶段。长期以来，研究者对人类及动物长非编码RNA进行了大量研究，但在植物中研究较少，对植物长非编码RNA功能解析尚不全面，目前，只有少数植物lncRNA研究较为详细。COOLAIR是与植物春化作用有关的天然反义转录本，该基因具有多种剪接方式，在植物开花期间，通过抑制植物开花因子FLC的表达，促进植物开花[6]。ASCO与拟南芥侧根的生长发育有关，通过对可变剪接调节因子的拦截，调控NSR和ASCO可变剪接模式，影响侧根生长[7]。Npc48通过影响miRNA参与转录后调控，影响拟南芥开花时间，其过表达植株有明显的叶锯齿，且其开花时间也明显推迟[8～9]。LDMAR与水稻花粉形成有关，降低LDMAR表达量，引起花药绒毡层细胞程序性死亡，从而影响水稻长日照条件下花粉的正常发育[10]。Zm401与玉米花粉特异性表达有关，通过影响花粉发育相关基因(ZmMADS2、MZm3-3)的表达，影响幼花药小孢子与绒毡层发育[11～12]。At4(AtIPS1)参与调节磷酸盐饥饿条件下拟南芥根对磷酸盐的摄取，研究发现，磷胁迫下诱导拟南芥根和茎中At4基因的表达[13]。

甘蓝(BrassicaoleraceaL. var.capitata)是十字花科(Brassicaceae)芸薹属(Brassica)植物，含有双拷贝的9个CC型基因组，包括花椰菜、结球甘蓝、西兰花等蔬菜，在人类饮食中占有重要地位。结球甘蓝是甘蓝中的一个变种，富含纤维、多种维生素和矿质元素等，具有消炎及抗癌作用。目前，甘蓝中只有少数非编码RNA被发现。宋江华等[14]通过PCR扩增方法从结球甘蓝中克隆出具有明显非编码RNA基因序列特征的BcMF11同源基因BoNR1(798 bp)，实验结果表明，BoNR1在结球甘蓝花药中特异表达，可能参与调控花粉发育过程。Wang等[15]从甘蓝中发现了193个miRNA，这些miRNA可能调控了186个代谢途径，包括脂质、能量、淀粉、糖类、脂肪酸和氮等代谢过程。Tian等[16]发现西兰花中81个盐应激miRNA，它们的靶基因与新陈代谢和细胞功能相关，这些miRNA在调控盐胁迫过程中，具有不可或缺的作用。Lukasik等[17]获得了结球甘蓝叶子中261个保守的潜在miRNA候选基因，它们可能参与了糖酵解、甘油脂代谢、类黄酮生物合成和氧化磷酸化等重要途径。

前期研究中，我们根据RNA聚合酶Ⅲ转录活性及其转录的非编码RNA基因结构特征，对拟南芥基因组进行计算检索，发现了RNA聚合酶Ⅲ转录的低氧应激应答型AtR8 lncRNA[18]；运用invotro转录系统与生化分析相结合的方法，我们发现了结球甘蓝中RNA聚合酶Ⅲ转录的AtR8 lncRNA同源物BoNR8 lncRNA(272nt)，其于结球甘蓝萌发种子根伸长区表皮层大量表达；拟南芥中BoNR8 lncRNA过表达影响了正常种子萌发、幼苗根生长和角果生长；盐应激及ABA应激下，BoNR8 lncRNA通过调节萌发相关ABA信号经路重要基因(RAV1、ABI3、ABI5)表达，降低了拟南芥萌发种子耐盐性及ABA不敏感性[19]。本研究进一步发现，BoNR8 lncRNA响应低温胁迫环境；低温应激下，BoNR8 lncRNA过表达降低了拟南芥种子萌发。BoNR8 lncRNA低温相关功能的发现为植物耐低温研究提供了新材料，丰富了植物耐低温作用机制的研究。

1 材料与方法

1.1 植物材料

野生型拟南芥(Arabidopsisthaliana,Columbia)种子，来源于：东北林业大学盐碱地生物资源与环境研究中心。结球甘蓝(BrassicaoleraceaL.)种子购于黑龙江省农科院蔬菜研究所。BoNR8 lncRNA过表达植株，通过农杆菌浸花法侵染野生型拟南芥植株花序，卡那霉素和Northern blot筛选出独立3株BoNR8 LncRNA过表达植株，将纯合T3代植物用于实验分析。

1.2 实验方法

1.2.1 植物培养基的配制

(1)1/2Ms培养基。称取2.37 g·L-1Ms粉，3%(w/v)蔗糖，1 m·L-1KOH调pH至5.7～5.8，0.8%(w/v)琼脂粉，120℃高温高压灭菌20 min。

(2)0.1 mm·L-1Na2WO4培养基。称取2.37 g·L-1Ms粉，3%(w/v)蔗糖，0.1 mm·L-1Na2WO4，1 m·L-1KOH调pH至5.7～5.8，0.8%(w/v)琼脂粉，120℃高温高压灭菌20 min。

1.2.2 冷应激应答处理

结球甘蓝种子经0.5%次氯酸钠和70%酒精(V/V)表面消毒、灭菌水洗4次后播种于1/2 Ms培养基上，吸胀48 h(4℃/暗)后转移到10℃培养箱(型号：HWS-250，智能恒温恒湿培养箱)中，低温处理18 h。

1.2.3 RNA提取方法

0.1 g结球甘蓝种子于液氮中彻底研磨后加入1 mL RNA提取液{45.5%(V/V)苯酚，9%(V/V)氯仿，0.45%(W/V)SDS，41 mm·L-1LiCl，2 mm·L-1EDTA，5.9 mm·L-1β-巯基乙醇，82 mm·L-1Tris-HCl}，离心取上清液并加入等体积PCI溶液(苯酚∶氯仿∶异戊醇=25∶24∶1)，离心取上层溶液，加入等体积氯仿，离心取上层溶液并加入1/3体积8 m·L-1LiCl，于-20℃静置一晚；第二日离心取上层溶液，加入1/4体积异丙醇，于-20℃静置30 min；离心取上层溶液并加入3/5体积异丙醇，-20℃静置30 min；离心得到RNA沉淀经75%(V/V)乙醇(DEPC水配制)洗涤后，加入适量DEPC水溶解，于-80℃中保存。

1.2.4 Northern blot

5 μg RNA经6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移至尼龙膜上，与Dig标记的AtR8 RNA变性探针过夜杂交。次日，将杂交后的膜放入含0.1% SDS(W/V)的2×SSC及0.2×SSC溶液中室温清洗2次，放入1.5% blocking(W/V)溶液中封闭1 h，与3 000倍稀释的Anti-Digoxigenin-AP抗体反应2 h。抗体反应结束后，马来酸洗液(含Tween 20)室温洗膜3次。膜与检测液(pH9.5)中CDP-Star暗处反应15 min后，于LAS-4000检测，Multi-Gauge对结果进行分析。

1.2.5 种子萌发率统计

我们将饱满的野生型、BoNR8 lncRNA过表达Bo1#、2#、3#拟南芥种子各30粒分别点在1/2Ms、0.1 mmol·L-1Na2WO4培养基上，吸胀处理72 h后(4℃/暗)，分别放入22℃培养箱(型号：PRX-450智能人工气候箱)以及10℃低温培养箱(型号：HWS-250智能恒温恒湿箱)中，16 h光照/8 h黑暗进行培养，统计1～7 d萌发情况。每个实验重复3次，并进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 BoNR8 lncRNA序列中冷应激单元的发现

Di等通过RNApromo数据库预测和描述了相同功能中lnc RNA的保守基序，发现了富含AU的茎环(AUC=0.948，P<0.001)响应冷应激，该基序(AGAGAAAGAAAG)在植物物种中是进化保守的，可以被其他调节因子(例如RNA结合蛋白)识别[20]。通过BLAST序列比对，我们发现BoNR8 lncRNA转录区域内存在冷应激单元(ATATAAATAAAT)，序列相似性达(67%，8/12)(图1A)。这个冷应激单元位于RNAlogo预测的BoNR8 lncRNA(rnalogo.mbc.nctu.edu.tw)茎环相连二级结构中的最大环状结构中(图1B)，这表明BoNR8 lncRNA可能响应低温胁迫。

2.2 结球甘蓝种子萌发期BoNR8 lncRNA响应低温胁迫应激

前期研究表明，BoNR8 lncRNA在结球甘蓝种子萌发期大量表达[19]。为此，我们提取22℃和10℃处理18 h的结球甘蓝萌发种子RNA，与Dig标记AtR8 lncRNA特异探针进行杂交，调查了低温胁迫条件下，结球甘蓝种子萌发期BoNR8 lncRNA表达变化。Northern分析表明，10℃处理18 h后结球甘蓝萌发种子中BoNR8 lncRNA明显被诱导(如图2所示)。

图1 BoNR8 lncRNA序列中冷应激单元的发现 A.BoNR8 lncRNA序列与冷应激单元的序列比较分析(USE、TATA启动子序列被大写加粗并加框，BoNR8 lncRNA转录区域被大写并加粗，高度保守序列用星号标注)；B.RNAlogo软件预测到冷应激单元存在BoNR8 lncRNA二级结构最大环状结构中(冷应激单元被大写加粗)Fig.1 Secondary structure and sequence characteristics of BoNR8 lncRNA A.Sequence comparison of BoNR8 lncRNA sequence with cold stress unit(The USE and TATA promoter sequences are bolded and framed, the BoNR8 lncRNA transcribed region is capitalized and bolded,and the highly conserved sequence is marked with an asterisk); B.The RNAlogo software predicted that the cold stress unit was present in the largest cyclic structure of the secondary structure of BoNR8 lncRNA(The cold stress unit is capitalized in bold)

图2 结球甘蓝种子萌发期BoNR8 lncRNA响应低温胁迫应激 SDS法提取正常培养及10℃处理18 h的结球甘蓝萌发种子RNA，Northern结果显示，10℃处理18 h后，BoNR8 lncRNA表达量增加。Fig.2 Expression characteristics of BoNR8 lncRNA in cold-treated cabbage seeds The RNA of germinated seeds of normal culture and 10℃ treatment for 18 h was extracted by SDS method.Northern results showed that the expression of lncRNA in BoNR8 increased after treatment at 10℃ for 18 h.

2.3 低温胁迫下BoNR8 lncRNA过表达抑制了拟南芥种子萌发

为了分析BoNR8 lncRNA功能，我们构建了BoNR8 lncRNA过表达载体，农杆菌转化法对拟南芥野生型植株花序进行侵染，筛选得到T3代纯合过表达植株(Bo1#、2#、3#)[19]，Northern结果表明，在Bo1#、2#、3#中，BoNR8 lncRNA被大量诱导(图3A)。我们分析了10℃低温条件下野生型Wt与Bo1#、2#、3#的萌发率。实验结果表明，1/2Ms培养基22℃培养条件下，Bo1#、2#、3#的萌发率低于野生型，这说明BoNR8 lncRNA影响种子的萌发(图3B)。低温处理同时抑制了野生型和Bo1#、2#、3#种子萌发，但对Bo1#、2#、3#抑制作用更强(图3B)。

ABA(脱落酸)是一种重要的植物激素。通常应激环境会导致植物体内ABA积累并抑制种子萌发。为此我们在培养基中加入钨酸钠(Na2WO4,ABA合成抑制剂)，调查了低温条件下Bo1#、2#、3#低萌发率是否与萌发种子体内ABA积累相关。实验表明，10℃低温处理条件下，添加钨酸钠并没有改变Bo1#、2#、3#的萌发趋势(图3B)，与低温、1/2Ms培养条件下萌发率趋势一致(图3B)，这说明低温抑制Bo1#、2#、3#萌发与萌发种子体内ABA含量变化无关。

3 讨论

低温是植物生长发育过程中普遍遇到的自然环境，限制植物的生长和发育，影响植物在自然界中的地理位置。低温可导致农作物冻伤，降低农作物产量，影响农作物经济效益。当植物遇到低温胁迫后，可以激发一系列细胞反应及应激途径，使植物适应低温胁迫，实现自身生命活动， 了解植物如何转导和响应冷信号一直是研究热点。遗传及分子研究已证实，CBF信号径路在低温胁迫中起到重要作用[21]，植物可通过激素如乙烯、茉莉酸等，协调CBF信号径路以适应低温胁迫。乙烯对植物抵抗低温胁迫具有积极作用，Shi等[22]发现，EIN3是参与乙烯信号径路的关键转录因子，通过结合EIN3启动子中EBS基序，影响CBF的表达，负向调控拟南芥低温耐受性。茉莉酸可调节ICE蛋白转录活性及CBF1的表达，正向调控CBF信号[23]。近期研究表明，大量miRNA参与调节植物低温胁迫过程，如miR394、miR397等。miR394对CBF信号径路具有正向调节作用，低温条件下，miR394过表达植株中，CBF1、CBF2和CBF3被大量诱导[24]。miR397也被证实可提高植物低温耐受性，4℃下，野生型植株停止生长，而miR397过表达植株可存活两个月[25]。目前研究尚未证实lncRNA是否参与调控CBF信号径路，对于lncRNA参与低温胁迫的作用机制尚不清晰，有待进一步发现。

图3 低温胁迫下BoNR8 lncRNA过表达抑制了拟南芥种子萌发 A.SDS法提取Wt、1#、2#、3#植株RNA，Northern结果显示，在Bo1#、2#、3#中，BoNR8 lncRNA被大量诱导；B.不同实验条件下，野生型和Bo1#、2#、3#萌发率分析Fig.3 Overexpression of BoNR8 lncRNA inhibits Arabidopsis seed germination under low temperature stress A.Wt,1#,2# and 3# plant RNA were extracted by SDS method,Northern results showed that BoNR8 lncRNA was induced in a large amount in Bo1#,2# and 3#; B.The germination rate of wild type and Bo1#,2#,3# was analyzed under different experimental conditions

本研究中，我们发现BoNR8 lncRNA序列中存在冷应激单元，且其存在二级结构中最大茎环处。低温胁迫诱导结球甘蓝种子中BoNR8 lncRNA的表达，且BoNR8 lncRNA过表达抑制拟南芥种子萌发。进一步实验表明，低温对BoNR8 lncRNA的影响，与ABA信号径路关联不大。本研究初步证明，lncRNA对于植物抵抗低温环境可能具有重要的意义，其中，BoNR8 lncRNA参与调节低温胁迫，可能影响种子萌发，幼苗发育等重要生命过程。

众所周知，低温对植物的生长、发育有着重要的影响，可以直接影响农作物的质量和产量，甘蓝是重要的经济作物，培育甘蓝耐低温品种，有着特殊的经济意义。目前，与低温胁迫相关的lncRNA还没有被大量报道，BoNR8 lncRNA研究为植物低温研究提供了新材料，为低温胁迫作用机制分析提供新的实验思路，有助于从植物长非编码RNA的角度阐述未清晰生理功能。今后我们将通过筛选结球甘蓝中缺失突变体等植物材料，结合过表达植株，进一步探究BoNR8 lncRNA与哪些低温胁迫的调节基因相关，这将对植物生长发育、遗传育种、抗病抗逆等方面具有重要意义。