高丽云 徐剑 李伟 陈乔稳 王凡 董章宏 瞿绍宏 常晓勇 辛培尧

摘要：【目的】建立華山松SSR-PCR最佳反应体系，为华山松种质资源的分子标记辅助育种、遗传多样性分析及遗传图谱构建研究提供理论参考。【方法】以华山松幼嫩针叶为材料，分别采用试剂盒法、SDS法和改良CTAB法提取华山松基因组DNA，确定华山松DNA最佳的提取方法。通过L16（44）正交试验设计对华山松SSR-PCR反应体系中引物用量（A）、dNTP用量（B）、Taq DNA聚合酶用量（C）和DNA模板用量（D）进行优化，获得华山松SSR-PCR最佳反应体系。【结果】改良CTAB法提取的基因组DNA浓度为92.1～1786.3 ng/μL，OD260/OD280为1.80～2.07，OD260/OD230比值约2.0，条带明亮且清晰，无弥散现象，表明该方法提取效果最佳。正交试验极差分析结果显示，4个因素影响华山松SSR-PCR反应体系扩增效果的主次顺序为A>D>B>C，最优水平组合为A4B2C2D2。正交试验方差分析结果显示，4个因素影响华山松SSR-PCR反应体系扩增效果的主次顺序为A>D>C>B，最优水平组合为A4D2C2B2。结合正交试验16个组合的评分结果，最终确定华山松SSR-PCR最佳反应体系（20.00 ?L）：10 ?mol/L引物0.35 ?L，50 ng/?L DNA模板1.00 ?L，10 mmol/L dNTP 2.00 ?L，5 U/?L Taq DNA聚合酶1.20 ?L，10×PCR Buffer（含Mg2+ 15 mmol/L）2.00 ?L，用ddH2O补足至20.00 ?L。【结论】优化获得的华山松SSR-PCR最佳反应体系可应用于华山松种质资源评价及分子标记辅助育种等研究。

关键词： 华山松;SSR-PCR反应体系;优化;DNA提取

Abstract：【Objective】To establish the optimal SSR-PCR reaction system for Pinus armandii Franch.，and provide the theoretical and practical guidance for the germplasm resources evaluation and molecular marker-assisted breeding of P.armandii. 【Method】The young planting needles of P.armandii were as materials. P.armandii genome DNA were extracted by DNA extraction kit，SDS method and modified CTAB method to find the best DNA extraction method of P.armandii  by comparing the three  results. Through the L16（44） orthogonal design， four factors of Taq DNA polymerase amount，dNTPs amount，primer amount and template DNA amount in the SSR-PCR reaction system of P.armandii were optimized to obtain the best P.armandii SSR-PCR reaction system. 【Result】The concentration of genomic DNA， which extracted by the improved CTAB method， was 92.1-1786.3 ng/μL， and OD260/OD230 was 1.80-2.07， the ratio of OD260/OD230 was about 2.0， and the bands were bright and clear， without dispersion phenomenon， indicating that this method had the best extraction effect. The range analysis results of orthogonal test showed that the four factors which affected the amplification effect of P.armandii SSR-PCR reaction system were： A>D>B>C， and the optimal level combination was： A4B2C2D2. Orthogonal test analysis of variance showed that the four factors affecting the amplification effect of P.armandii SSR-PCR reaction system were： A>D>C>B， and the optimal level combination was： A4D2C2B2. Combining the scoring results of 16 combinations of orthogonal experiments， the best reaction system for SSR-PCR of P.armandii（20.00 ?L） was as follows： 0.35 μL primer（10 μmol/L）;1.00 μL template DNA （50 ng/μL）;2.00 μL dNTP （10 mmol/L），1.20 μL（5 U/μL） Taq DNA polymerase and 2.00 μL of 10×PCR Buffer（containing Mg2+ 15 mmol/L），then added to a volume of 20.00 μL with ddH2O. 【Conclusion】The optimal reaction system of P.armandii SSR-PCR  can be applied to the evaluation of germplasm resources and molecular marker-assisted breeding of P.armandii.

0 引言

【研究意义】华山松（Pinus armandii Franch.）又名白松，隶属于松科（Pinaceae）松属（Pinus）单维管束亚属的高大常绿乔木，是我国特有的五针松树种（辛培尧等，2010）。华山松生长较快，材质优良，其木材可作为建筑、家具原料，树干可割取松脂，树皮可提炼拷胶，针叶可提炼芳香油，种子还可食用。因此，华山松被我国多个省（区）引种造林。但由于人们沿袭“见树采种，见种造林”的习惯，导致人工林分质量不高、病虫害控制能力较差，致使其生长量持续减少，出现严重的衰退现象（孙海燕等，2007;辛培尧等，2010）。目前，运用遗传改良手段选育良种是华山松种质创新的有效途径之一。其中，以特异引物PCR为基础的分子标记辅助育种技术广受人们青睐，可在育种早期较准确地检测目标性状，从而达到苗期高效选择的目的。SSR分子标记已广泛应用于植物遗传多样性分析、遗传图谱构建、基因定位等研究（孙文婷等，2016;冯飞等，2018;邱芬等，2018;庞新华等，2019）。因此，优化华山松SSR-PCR反应体系对研究华山松的辅助育种及遗传多样性分析具有重要意义。【前人研究进展】目前，已有大量采用正交设计或单因素试验等方法对思茅松、火炬松和云南松等树种SSR-PCR反应体系进行优化的研究报道。张冬梅等（2007）分析了Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、引物及DNA模板等因素对PCR扩增产物结果的影响，建立了一套稳定可靠的油松SSR-PCR反应体系。冯富娟等（2010）采用单因素试验与正交试验相结合的方法对影响红松SSR-PCR扩增效果的DNA模板、Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶、延伸时间和循环次数等进行优化，建立了稳定的红松SSR-PCR最佳反应体系和扩增程序。邵俊培等（2012）采用单因素试验对马尾松EST-SSR PCR反应体系中各组分及退火温度对扩增效果的影响进行研究，并对优化后的体系和扩增程序进行验证。张瑞丽等（2012）、蔡年辉等（2013）分别采用正交试验和单因素试验分析云南松SSR-PCR反应体系中各组分对扩增效果的影响，筛选出各因素的最佳水平。何卫龙等（2013）利用正交试验，以马尾松胚乳DNA为模板进行SSR-PCR反应体系优化，建立了最佳SSR-PCR反应体系。张蝶等（2016）采用单因素试验和正交试验相结合的方法对SSR-PCR反应体系的DNA模板、引物、dNTPs、Mg2+和Taq DNA聚合酶进行优化，从而获得火炬松SSR-PCR最佳反应体系。王大玮等（2018）以思茅松基因组DNA为模板，对SSR-PCR反应体系中的DNA模板、Mg2+、引物、Taq DNA聚合酶和dNTPs进行正交试验，建立了一套稳定可靠的SSR-PCR反应体系，可用于思茅松遗传多样性研究。【本研究切入点】虽然Dong等（2016）、祝娟（2016）利用SSR分子标记对华山松及其近缘种的群体遗传学和物种形成进行研究，但未对华山松SSR-PCR反应体系进行优化。目前，鲜见运用正交试验和SSR分子标记对华山松SSR-PCR反应体系各组分进行优化的研究报道。【拟解决的关键问题】以幼嫩无病虫害的华山松针叶为材料，采用改良CTAB法提取华山松基因组DNA，通过L16（44）正交试验对华山松SSR-PCR反应体系中的Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物和DNA模板等4个组分进行优化，以获得最佳的SSR-PCR反应体系，为华山松的分子标记辅助育种、遗传多样性分析及遗传图谱构建等研究提供理论参考。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试华山松种源为云南会泽、巍山、腾冲、楚雄、南华和宜良，种植于云南省楚雄市紫溪山紫金山林场华山松无性系种子园内（表1）。Taq DNA聚合酶、10×PCR Buffer（含15 mmol/L Mg2+）和dNTPs均购自北京博迈德基因技术有限公司;DNA Marker为1500 bp广谱高密度分子量标准，购自北京天恩泽基因科技有限公司;Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司。主要仪器设备：低温高速離心机、微量迷你离心机FC5306[奥豪斯国际贸易（上海）有限公司]、PCR扩增仪（S1000 Thermal Cycler，美国Bio-Rad）、琼脂糖凝胶电泳仪（JY100型，北京君意东方电泳设备有限公司）、超微量紫外分光光度计（NanoDrop 2000，美国Thermo Scientific）、凝胶成像系统（SYNGENEG：BOX）等。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 样品采集 分别采集华山松当年生幼嫩无病虫害的针叶，按单株编号并装入自封袋内，置于-80 ℃冰箱保存。

1. 2. 2 基因组DNA提取 随机选取10个华山松无性系针叶样品，分别采用试剂盒法（Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒）、SDS法和改良CTAB法提取华山松基因组DNA，利用超微量紫外分光光度计检测其纯度和浓度，并用0.8%琼脂糖凝胶电泳进行检测并拍照（谢冬梅等，2014），比较3种方法的提取效果，筛选出最佳的华山松基因组DNA提取方法。

1. 2. 3 引物初筛 利用会泽、巍山、腾冲和楚雄4个种源的华山松无性系基因组DNA进行PCR扩增。所用SSR引物序列（祝娟，2016）见表2，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测，筛选出扩增效果较好的SSR引物用于SSR-PCR体系优化。

1. 2. 4 正交试验 从6个华山松种源的样品中各选一个无性系，以其基因组DNA为模板，利用初筛出的SSR引物进行SSR-PCR反应体系优化。以引物（10 ?mol/L）、dNTPs（10 mmol/L）、Taq DNA聚合酶（5 U/μL）和DNA模板（50 ng/mL）的用量为4个因素进行L16（44）正交试验（李春喜等，2008）。每个因素设4个水平（表3），2次重复，每重复16个组合。按照表4配制SSR-PCR反应体系，各体系均加入2.00 μL 10×PCR Buffer缓冲液，用ddH2O补足至20.00 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min;94 ℃ 50 s，52 ℃ 90 s，72 ℃ 1 min，进行30个循环;72 ℃延伸10 min，扩增产物4 ℃保存。

1. 3 统计分析

根据扩增产物条带清晰明亮度、弥散程度及特异性等对各组合的电泳图谱进行直观评分（1～16分）（何正文等，1998）。其中，条带清晰、特异性高、无弥散的处理计为16分，条带浅、弥散严重、无特异性的处理计为1分。对2次重复打分的结果进行极差分析，计算每因素在同一水平下的试验值之和（Ki）、平均值（Xi）及各因素不同水平下的极差（R），并利用SPSS 19.0进行方差分析。

2 结果与分析

2. 1 华山松基因组DNA提取结果

用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测3种方法提取的华山松基因组DNA，结果如图1所示。试剂盒法提取的基因组DNA条带不清晰，弥散明显;SDS法提取的基因组DNA条带整齐但颜色较浅，且操作用时较长;改良CTAB法提取的基因组DNA条带明亮且清晰，无弥散现象，表明改良CTAB法提取效果最佳。

改良CTAB法提取的华山松DNA浓度和纯度经超微量紫外分光光度计检测，结果显示DNA浓度为92.1～1786.3 ng/μL，OD260/OD280为1.80～2.07，OD260/OD230约2.0，DNA目的条带清晰完整、无弥散现象。

2. 2 引物筛选结果

如图2所示，6对SSR引物均能扩增出明显的目的条带，其中，引物H11的扩增效果最佳。因此，利用该引物进行华山松SSR-PCR反应体系优化。

2. 3 正交试验结果

2. 3. 1 评分及极差分析结果 由图3和表5可知，16个处理中，处理1～8和处理12的条带较弱，评分较低，尤其是处理1几乎无条带，处理9、14、15和16的条带较亮，评分较高，其中又以处理14的评分最高。R反映各因素对华山松SSR-PCR反应体系的影响程度，R越大，说明该因素对反应体系的影响越显著。正交试验结果（表6）显示，RA>RD>RB>RC，因此，4个因素影响华山松SSR-PCR反应体系扩增效果的主次顺序为：A>D>B>C，即引物用量>DNA模板用量>dNTPs用量>Taq DNA聚合酶用量，说明引物用量对华山松SSR-PCR反应体系擴增效果的影响最大，Taq DNA聚合酶用量的影响最小。A因素4个水平的扩增效果排序为：A4>A3>A2>A1，即引物用量为0.35 ?L时扩增效果最佳;B因素4个水平的扩增效果排序为：B2>B4>B3>B1，即dNTPs用量为1.80 ?L时扩增效果最佳;C因素4个水平的扩增效果排序为：C2>C1>C4>C3，即Taq DNA聚合酶用量为1.20 ?L时扩增效果最佳;D因素4个水平的扩增效果排序为：D2>D3>D4>D1，即DNA模板用量为1.00 ?L时扩增效果最佳。综上所述，最优水平组合为A4B2C2D2，即引物用量0.35 ?L、dNTPs用量1.80 ?L、Taq DNA聚合酶用量1.20 ?L、DNA模板用量1.00 ?L。

2. 3. 2 方差分析结果 由表7可知，引物用量对华山松SSR-PCR反应体系扩增效果的影响达极显著水平（P<0.01，下同），需要进行多重比较分析;Taq DNA聚合酶用量、DNA模板用量和dNTPs用量对华山松SSR-PCR反应体系的影响不显著（P>0.05，下同），无需进行多重比较分析。由表7还可知：FA>FD>FC>FB，即影响华山松SSR-PCR反应体系扩增效果的主次顺序为：引物用量>DNA模板用量>Taq DNA聚合酶用量>dNTPs用量，与极差分析结果略有差异。根据正交试验方差评分的估算边际均值（图4）可知，A因素4个水平的扩增效果排序为：A4>A3>A2>A1，即引物用量为0.35 ?L时扩增效果最好，与极差分析结果一致;B因素4个水平的扩增效果排序为：B2>B4>B3>B1，即dNTPs用量为1.80 ?L时扩增效果最好，与极差分析结果一致;C因素4个水平的扩增效果排序为：C1>C2>C4>C3，即Taq DNA聚合酶用量为1.10 ?L时扩增效果最佳，与极差分析结果存在差异;D因素4个水平的扩增效果排序为：D3>D2>D4>D1，即模板DNA用量为1.5 ?L时扩增效果最好，与极差分析结果存在差异。综上所述，最优水平组合为：A4D2C2B2，即引物用量0.35 ?L、DNA模板用量1.50 ?L、Taq DNA聚合酶用量1.10 ?L、dNTPs用量1.80 ?L。

2. 3. 3 引物用量的多重比较分析结果 对引物用量进行多重比较分析，结果如表8所示。引物用量在水平3与水平4间差异不显著（P>0.05），二者均极显著大于水平2和水平1;而水平2极显著大于水平1。因此，引物用量0.30和0.35 ?L时扩增效果较好。

3 讨论

提取高质量的基因组DNA是分子试验的重要环节。但松属植物的针叶内含较多次生代谢产物和多糖，多糖会抑制聚合酶、连接酶等分子生物学酶类的活性，因此从中提取质量好、纯度高的DNA较困难（谢冬梅等，2014）。谢冬梅等（2014）以华山松针叶为材料，分别采用改良CTAB法、Zigenhagen法等4种方法提取华山松基因组DNA，结果发现改良CTAB法提取的基因组DNA稳定性最好，纯度最高。本研究分别采用试剂盒法、SDS法和改良CTAB法3种方法提取华山松基因组DNA，结果发现，改良CTAB法提取华山松DNA的效果最佳。与谢冬梅等（2014）的研究结果基本一致。究其原因是改良CTAB法可有效地去除样品中含有的多糖、色素、黄酮等杂质，因此也可用于提取其他松科植物的DNA。

本研究采用L16（44）正交试验设计对影响华山松SSR-PCR体系扩增效果的4个因素进行优化，参考何正文等（1998）的直观评分法对扩增产物的电泳图谱进行评分，并通过极差分析和方差分析获得最佳的SSR反应体系。董胜君等（2019）、王开芳等（2019）也使用直观评分法分别对毛梾和野杏SSR-PCR反应体系进行优化。可见，直观评分法是一种便捷、通用的方法。本研究的极差分析结果表明，华山松SSR-PCR反应体系中的引物、DNA模板、dNTPs、Taq DNA聚合酶的最佳用量分别为0.35、1.00、1.80和1.20 ?L;但方差分析结果表明，华山松SSR-PCR反应体系中的引物、模板DNA、dNTPs、Taq DNA聚合酶的最佳用量分别为0.35、1.50、1.80和1.10 ?L，且引物用量对华山松SSR-PCR反应体系扩增效果的影响达极显著水平;多重比较分析结果显示，引物用量为0.30和0.35 ?L时扩增效果较好。当极差分析和方差分析得出的最佳组合存在极小差异时，应考虑交互作用（辛益军，2001）。结合本研究正交试验16个组合的评分结果（表5）可知，组合14的扩增效果最佳，引物的最佳用量为0.35 ?L;DNA模板的最佳用量为1.00 ?L，其原因是DNA模板量过多时，不仅会增加非特异性产物，还会抑制Taq DNA聚合酶的活性;dNTPs和Taq DNA聚合酶的最佳用量为2.00和1.20 ?L，表明dNTPs和Taq DNA聚合酶用量过低或过高时扩增出的条带不清晰。因此，最终确定的华山松SSR-PCR最佳反应体系（20.00 ?L）：10 ?mol/L引物0.35 ?L，50 ng/?L DNA模板1.00 ?L，10 mmol/L dNTPs 2.00 ?L，5 U/?L Taq DNA聚合酶1.20 ?L，10×PCR Buffer（含15 mmol/L Mg2+）2.00 ?L，用ddH2O补足至20.00 ?L。

目前，大量研究人员利用SSR分子标记对华山松进行遗传分析时均使用Taq PCR Mix（Dong et al.，2016;祝娟，2016）。虽然Taq PCR Mix在操作时相对方便，但不同品牌不同型号的Taq PCR Mix的扩增效果存在明显差异。本研究分别对华山松SSR-PCR反应体系中的dNTPs、Taq DNA聚合酶、DNA模板和引物的用量进行具体分析及筛选，能较精准地确定各因素对PCR扩增的影响大小，进而获得最佳的反应体系，促使实验结果更加稳定可靠。

4 结论

华山松SSR-PCR最佳反应体系（20.00 ?L）为：10 ?mol/L引物0.35 ?L，50 ng/?L DNA模板1.00 ?L，10 mmol/L dNTPs 2.00 ?L，5 U/?L Taq DNA聚合酶1.20 ?L，10×PCR Buffer（含Mg2+ 15 mmol/L）2.00 ?L，用ddH2O补足至20.00 ?L。该体系可应用于华山松种质资源评价及分子标记辅助育种等研究。

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（责任编辑 陈 燕）