卢家仕 韦绍龙 黄素梅 韦弟 李朝生 龙盛风 覃柳燕

摘要：【目的】采用ISSR分子標记对13份广西收集引进和选育的香蕉种质资源进行遗传多样性分析，为广西香蕉品种改良及枯萎病抗性育种提供参考依据。【方法】从100条ISSR引物中筛选出多态性引物进行PCR扩增，利用PoPgen 1.32计算遗传多样性指数，DICE法计算遗传相似系数。利用非加权平均距离法（UPGMA）进行聚类分析。【结果】共筛选出8条扩增产物条带清晰、多态性好的ISSR引物，利用其从13份香蕉种质材料中扩增出234条条带，平均每条引物扩增出29.25条条带，其中多态性条带229条，多态性比率97.86%，平均观察等位基因数（Na）1.9786、有效等位基因数（Ne）1.4023、Shannon多样性信息指数（I）0.2603、Neis基因多样性指数（H?）0.4135。13份香蕉种质材料的遗传相似系数为0.50～0.90，其中，巴贝多与GK1的遗传相似系数最小，为0.50，抗枯1号与抗枯5号的遗传相似系数最大，为0.90。在遗传相似系数0.59处可将13份香蕉种质资源聚成四大组，其中第Ⅱ组在相似系数0.74处被分为a和b亚组。在遗传相似系数0.90处可将13份香蕉种质材料完全区分开。【结论】广西香蕉种质资源的遗传多样性非常丰富。利用ISSR分子标记可将遗传背景及形态特征不同的香蕉种质资源进行有效分类，可用于香蕉种质资源分类、亲缘关系鉴定及辅助育种等研究。

关键词： 香蕉;种质资源;ISSR分子标记;遗传多样性;亲缘关系;聚类分析

Abstract：【Objective】The genetic diversity and the genetic relationship among 13 accessions of introduced and bred banana germplasm resouces in Guangxi were analyzed by using molecule marker technique of inter-simple sequence repeat（ISSR） in order to provide references for banana variety improvement and breed of fusarium wilt resistant varieties in Guangxi. 【Method】The polymorphic primers were screened from 100 ISSR primers for PCR amplification. The genetic diversity index was calculated by PoPgen 1.32 soft and the genetic similarity coefficient was calculated by DICE method. Furthermore， the cluster analysis of different banana germplasm resources was analyzed by using unweighted pair-group method with arithmetic means（UPGMA）. 【Result】Eight ISSR primers，that could amplify stable and clear bands with fine polymorphism， were screened from 100 ISSR primers.The 234 bands in total were amplified from 13 accessions of banana germplasm resources， and each primer in average could amplify 29.25 bands. Of which， 229 amplified bands were present polymorphic and the polymorphism rate was 97.86 %. Through analysis of genetic diversity， the mean observed number of alleles（Na） was 1.9786， the effective number of alleless（Ne） was 1.4023，  the Shannons Information index（I） was 0.2603 and the Neis genetic diversity index（H） was 0.4135. The genetic similar coefficient among 13 accessions ranged from 0.50 to 0.90; the genetic similarity coefficient between Barbados and GK1 was the lowest with 0.50， and that of Kangku 1 and Kangku 5 was the highest with 0.90. The 13 accessions could be classified into four groups（I，II， III and IV） at the genetic similarity coefficient of 0.59， and the II group could be divided into two subgroups（a and b） at the similarity coefficient of 0.74. Meanwhile， 13 accessions could be completely distinguished at the genetic similarity coefficient of 0.90. 【Conclusion】The banana germplasm resources in Guangxi present very rich genetic diversity. The genetic background and the morphological difference can be effectively classified by using the ISSR molecular marker technique，which would be helpful for germplasm resources classification， identification of genetic relationship and banana assisted breeding.

0 引言

【研究意义】香蕉是芭蕉科芭蕉属多年生草本植物，是热带亚热带地区的重要水果，栽培面积大，其产量较柑橘、葡萄和苹果高，被誉为“世界果王”（许林兵，2006）。我国南部是香蕉原产地之一。香蕉栽培品种多数为三倍体，主要由两个野生品种尖叶蕉（A基因组）与长梗蕉（B基因组）种内或种间杂交、变异、进化而成（秦献泉等，2007;牟海飞等，2010）。根据植株形态特征和经济特性，我国主要食用香蕉可分为香牙蕉（AAA）、大蕉（ABB）、粉蕉（ABB）、龙牙蕉（AAB）和贡蕉（AA）等五大类（张展伟，2010）。由于植物性状通常受环境因素和遗传基因的影响导致品种特性发生改变，仅靠形态特征较难区分开来，不利于种质资源保护及开发利用。分子标记技术不受环境条件和植物生长发育的影响，已被广泛用于植物种质资源的遗传多样性及亲缘关系分析，为分子辅助育种提供技术支持。因此，利用分子标记技术开展香蕉种质资源的遗传多样性分析，探究其亲缘关系，对香蕉种质资源开发利用及抗病品种选育具有重要意义。【前人研究进展】目前，已有大量利用分子标记技术开展香蕉遗传多样性分析的研究报道。于晓英（2001）、谭卫萍等（2010）利用AFLP分子标记对香蕉种质资源进行遗传多样性分析。陈源等（2008）利用RAPD分子标记对香蕉种质资源进行遗传多样性分析。李博等（2011）利用cqSSR分子标记对香蕉种质资源进行遗传多样性分析。谢子四等（2012）、漆艳香等（2017）分别利用SRAP分子标记对香蕉种质资源进行遗传多样性分析。孙嘉曼等（2016）、林丹銮（2017）分别利用 SSR分子标记对香蕉种质资源进行遗传多样性分析。以上分子标记较稳定、可靠、操作简便，不受外部环境条件干扰，但存在一些缺点，如AFLP分子标记需要高质量的DNA模板及制胶技术，RAPD分子标记重复性较差，SSR和cqSSR分子标记的引物开发较因难，SRAP分子标记则需要分别设计其正、反向引物再两两配对筛选引物，实验操作较复杂。ISSR分子标记克服了上述分子标记的缺点，具有对DNA模板质量要求低、引物设计容易、操作简单、多态性好、可重复性高等优点，已广泛应用于对香蕉种质资源的遗传多样性分析研究，如刘绍钦等（2007）、牟海飞等（2010）分别利用ISSR分子标记对广东选育和国外引进的香蕉种质资源进行遗传多样性分析。【本研究切入点】目前，鲜见利用ISSR分子标记对广西收集引进和选育的香蕉种质资源进行遗传多样性分析的研究报道。【拟解决的关键问题】以广西收集和选育的香蕉种质资源为研究对象，采用ISSR分子标记分析其遗传多样性及亲缘关系，为广西香蕉枯萎病抗性育种及品种改良提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试香蕉种质名称及来源见表1。Taq DNA Polymerase、超純水和dNTPs购自生工生物工程（上海）股份有限公司;ISSR引物、酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）、氯仿∶异戊醇（24∶1）、2% β巯酯乙醇和其他生化试剂均购自国拓生物技术有限公司。主要仪器设备：Grant GR150水浴锅（GR150-12，英国）、Bio Photometer RNA/DNA浓度电度测定仪（Eppendorf，德国）、Biometra TProfessional PCR仪（Tprofe，德国）、MixMate PBC-11 5353混匀仪（Eppendorf，德国）、MIKRO 220R 2205冷冻离心机（HETTICH，德国）、EN 61010-1电泳仪（Bio-Rad，美国）、DYCP-31DN型电泳槽（北京市六一仪器厂）和Firereader XS D-56-26.M凝胶成像系统（UVI，英国）等。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 基因组DNA提取 采集香蕉新鲜完全未展开心叶，参考改良的CTAB法（卢家仕等，2012）提取其基因组DNA，并用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测其质量，紫外分光光度计检测其浓度和纯度。

1. 2. 2 ISSR引物合成及筛选 利用加拿大哥伦比亚大学设计并公布的100条ISSR引物序列，由国拓生物技术有限公司合成。同时选取抗枯萎病品系GK1和主栽的感枯萎病品种桂蕉1号进行引物初筛，从中筛选出扩增产物条带清晰、多态性好的引物用于后续试验。

1. 2. 3 ISSR反应体系及扩增程序 反应体系20.0 μL：10×Buffer 2.0 ?L，10 mmol/L dNTPs 0.4 ?L，5 U/?L Taq DNA Polymerase 0.2 ?L，10-5 ?mol/?L引物1.0 ?L，40 ng/?L DNA模板1.5 ?L，超纯水补足至20.0 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min;94 ℃ 50 s，50～55 ℃ 50 s，72 ℃ 2 min，共进行38个循环;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR扩增反应在Biometra TProfessional PCR仪上完成。扩增产物加入3.5 uL含核酸染料的6×Loading Buffer充分混匀后取其10.0 ?L用1.8%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳缓冲液为1×TAE，电压110 V，电泳时间50 min，在凝胶成像系统上拍照观察。

1. 3 统计分析

观察ISSR-PCR扩增产物的电泳图谱，同一水平线上有条带记为1，无条带记为0，得到[0，1]矩阵，统计条带数量。将[0，1]矩阵导入PoPgen 1.32计算多态性比率、观察等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、Shannon多样性信息指数（I）和Neis基因多样性指数（H?）等遗传多样性指数。最后将[0，1]矩阵导入NTsys 2.10e，利用DICE法计算遗传相似系数，用非加权平均距离法（UPGMA）进行聚类分析，构建系统发育进化树。

2 结果与分析

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（责任编辑 陈 燕）