刘露露 曲俊杰 郭泽西 孙大运 潘凤英 尹玲

摘要：【目的】構建霜霉菌侵染后葡萄叶片的酵母双杂交cDNA文库，筛选致病因子在寄主葡萄体内的互作靶标，为葡萄霜霉病菌致病的分子机理研究提供材料基础。【方法】以一年生欧亚种葡萄西拉盆栽苗为试验材料，提取并等量混合霜霉菌侵染后0、12、18、24和36 h的葡萄叶片总RNA，利用基于Gateway技术的CloneMiner II cDNA文库构建试剂盒：首先将cDNA与pDONR222载体进行BP重组反应连接，连接产物转化大肠杆菌DH10B感受态细胞构建初级文库;然后初级文库质粒与pGADT7-DEST载体通过LR重组反应，重组反应产物转化大肠杆菌DH10B感受态细胞构建次级文库;再随机挑取次级文库转化Y187酵母菌株构建酵母双杂交cDNA文库;最后利用ImageJ软件和PCR反应分别统计库容量和鉴定重组率。【结果】构建的初级文库库容量为4.6×107 CFU，次级文库库容量为2.7×107 CFU，均达到构建cDNA文库的标准。酵母双杂交cDNA文库的插入片段主要集中在1000～2000 bp，且具有很好的多态性，文库质量较高。【结论】构建的霜霉菌诱导葡萄叶片酵母双杂交cDNA文库符合酵母双杂交筛选要求，可用于筛选霜霉菌致病效应蛋白在寄主体内的靶标及霜霉菌侵染寄主葡萄早期抑制寄主免疫过程中的致病机理研究。

关键词： 霜霉菌;葡萄;酵母双杂交;cDNA文库

Abstract：【Objective】To construct yeast two-hybrid cDNA library of grape leaves after downy mildew infection， screen the target of pathogenic factors in host grapes and provide reference for molecular mechanism of pathogenic factors of Plasmopara viticola. 【Method】Total RNA was extracted and mixed fromgrape leaves of Vitis vinifera Shiraz one-year potted seedlings at 0，12，18，24 and 36 h after downy mildew infection. The library was constructed using the CloneMiner II cDNA library construction kit based on Gateway technology. The cDNA was ligated into the pDONR222 vector by BP recombination reaction， and the ligation product was transformed into Escherichia coli DH10B competent cell to construct a primary library. Then the primary library plasmid was introduced into the pGADT7-DEST vector by LR recombination reaction， recombinant reaction products transformed E. coli DH10B competent cell to construct primary library， and secondary libraries were randomly selected to transform Y187 yeast strain to construct yeast two-hybrid cDNA library. The library capacity was counted by ImageJ software and the recombination rate was identified by PCR. 【Result】The tests showed that the capacity of the primary library obtained by the experiment was 4.6×107 CFU， the capacity of secondary library was  2.7×107 CFU， reaching the standard to construct cDNA library. The inserts of the yeast twohybrid cDNA library were mainly concentrated at 1000-2000 bp and had good polymorphism. The library quality was high. 【Conclusion】A high-quality yeast two-hybrid cDNA library from grape leaves infected with downy mildew is obtained in this experiment. It meets the requirements of yeast two-hybrid screening， is a target that can be used to screen downy mildew pathogenic effect proteins in the host， and study the pathogenic mechanism during the early inhibition on host immunity of downy mildew infected host grapes.

0 引言

【研究意义】葡萄是经济价值较高的果树之一，2018年国际葡萄及葡萄酒组织（OIV）发布的全球葡萄种植及葡萄酒生产、消费和贸易统计数据显示，我国已成为全球第二大葡萄种植国，但生产上葡萄病害的流行限制了我国葡萄与葡萄酒产业的可持续发展。葡萄霜霉病是葡萄产业上危害严重的一大卵菌病害，其病原菌是葡萄霜霉菌（Plasmopara viticola），在植物十大病原卵菌排名中位居第六（Kamoun et al.，2015）。因此，构建霜霉菌侵染后葡萄叶片酵母双杂交cDNA文库，用于筛选霜霉菌效应蛋白在寄主中的互作靶标，以深入研究葡萄霜霉菌效应蛋白早期抑制葡萄免疫反应过程的机理，可为今后基于靶标研发新型杀菌剂提供理论依据。【前人研究进展】过去的十多年，对葡萄霜霉菌的研究主要集中在种群遗传多样性、遗传结构及不同种群对杀菌剂的敏感性或抗药性等方面。迄今为止，尚未明确我国葡萄霜霉菌种群的遗传多样性和起源，但有学者认为我国葡萄霜霉菌是地方性和引进菌株的混合体（Zhang et al.，2017a）;在基因流动性大且重组更频繁的地区，葡萄霜霉菌的遗传多样性更广泛（Boso et al.，2019）。生产上对霜霉病的防治一直以化学防治为主，经常使用的两类杀菌剂是保护性杀菌剂和内吸性杀菌剂，但目前在国内已发现对烯酰吗啉和嘧菌酯具有抗性的霜霉菌菌株（王喜娜，2017;Zhang et al.，2017b）。近年来，随着高通量测序技术的发展，对病原菌致病分子机理的研究得到迅猛发展，尤其是对病原菌效应蛋白互作靶标的研究取得了很多突破性进展。研究表明，疫霉菌通过产生糖基水解酶（Ma et al.，2015）和果胶裂解酶（Fu et al.，2015）等类型的质外体效应蛋白破坏宿主细胞壁的物理屏障以获得营养，发挥毒力;通过蛋白酶、蛋白酶抑制剂等其他几种类型的质外体效应蛋白作用于寄主植物的β-1，3-葡聚糖酶（Bishop et al.，2005）、丝氨酸蛋白酶（Tian et al.，2004，2005）和半胱氨酸蛋白酶（Song et al.，2009;Kaschani et al.，2010）等PTI（PAMP-triggered immunity，病原相关分子模式触发的免疫反应）过程相关的不同靶标来干扰寄主的免疫反应，促进侵染。胞内效应蛋白则靶向多种防卫相关途径促进其侵染，如26S蛋白酶体降解（Bos et al.，2010;Yang et al.，2016）、激素抗病信号（Evangelisti et al.，2013）、丝裂原活化蛋白激酶抗病信号（King et al.，2014）、活性氧代谢（Zhang et al.，2015）及内质网胁迫（Jing et al.，2016）等。在葡萄霜霉菌中，目前仅发现PvRxLR131能靶向富含亮氨酸重复序列的类受体蛋白激酶（Leucine-rich repeat receptor-like protein kinase，LRR-RLK）相关的抑制子BKI1来干扰寄主的防御促进侵染（Lan et al.，2019）。本课题组相继完成了葡萄霜霉菌的转录组和全基因组测序，并通过生物信息学方法挖掘出大量的致病基因，共鉴定出1301个假定的分泌蛋白，包括100个RXLR（R： 精氨酸;X： 任意氨基酸：L： 亮氨酸）类型的效应蛋白和90个CRN（Crinkling and necrosis protein，皱缩坏死蛋白）类型的效应蛋白（Yin et al.，2015，2017）。【本研究切入点】本课题组前期已从葡萄霜霉菌基因组和转录组中克隆出82个候选RXLR效应蛋白基因，并通过烟草叶片瞬时表达系统明确其对植物免疫的抑制作用，以及这些效应蛋白进入植物体后发挥作用的位置（Xiang et al.，2017;Liu et al.，2018），但其作用靶标及具体的致病机理尚不明确。【拟解决的关键问题】利用Gateway体系，采用Gateway位点特異性重组技术（Cloneminer cDNA library construction kit）构建西拉葡萄叶片在霜霉菌侵染下的酵母双杂交文库，以期用于筛选霜霉菌效应蛋白在葡萄叶片中的互作靶标，为研究葡萄霜霉病菌致病的分子机理提供材料基础。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试葡萄品种为一年生欧亚种葡萄西拉盆栽苗，种植在广西农业科学院科研核心区玻璃温室。试验所用葡萄霜霉菌菌株由广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室分离保存。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 霜霉菌侵染 采用离体叶盘接种法，用蒸馏水将葡萄枝条顶端完全伸展的第3～5片叶清洗干净，用吸水纸擦干备用。将葡萄叶片用打孔钳打成直径为1 cm的叶盘（避开主叶脉和较大侧叶脉），叶盘背面朝上置于铺有完全湿润滤纸的培养皿上。吸取35 μL霜霉菌孢子囊悬浮液（浓度5×105个孢子囊/mL）滴于每个叶盘背面，23 ℃、16 h/8 h光周期培养12 h后，用滤纸吸取多余的菌液，叶盘继续培养，分别于接种0、12、18、24和36 h后取样，每个时间点采集12个叶盘，液氮速冻后-80 ℃保存。

1. 2. 2 RNA提取、反转录 采用Spectrum Plant Total RNA Kit （Sigma）提取各时间点叶片的总RNA，1%琼脂糖凝胶检测RNA质量和浓度;将每个时间点的RNA等量混合成一个样品，利用NanoDrop和Agilent 2100检测混合后样品的质量和浓度;使用Oligotex mRNA Midi Kit进行mRNA分离纯化，并以1%琼脂糖凝胶检测其质量，用NanoDrop 2000分光光度计检测其浓度。

1. 2. 3 初级文库（Uncut型）构建及保存 参照CloneMiner II cDNA文库构建试剂盒说明，在上一步得到的mRNA中加入Biotin-aatB2-Oligo（dT）Primer和SuperScript Ⅲ RT酶进行反转录，得到cDNA的第一链;再以得到的cDNA第一链为PCR模板，加入大肠杆菌DNA Ligase、大肠杆菌DNA Polymerase I、大肠杆菌RNase H及T4聚合酶合成cDNA的第二链;cDNA与三框attB1重组接头连接（3种接头分别各连接1份），目的是在链末端连接attB1序列。然后利用cDNA Size Fraction Columns对cDNA进行分级分离和收集，收集500～4000 bp的双链cDNA。将收集到的双链cDNA与pDONR222载体混合，通过BP重组反应连入载体。重组产物电转化导入大肠杆菌DH10B感受态细胞中，摇菌培养（37 ℃，220 r/min，1 h）获得cDNA文库。培养1 h后，取转化后大肠杆菌原液10 ?L，将其稀释100倍后，吸取50 ?L稀释液涂布LB培养基（含氨苄青霉素），从而进行库容量鉴定;从培养基上长出的菌落中随机挑取24个单克隆，进行菌落PCR鉴定，对其插入片段长度和重组率进行分析;在剩余菌液中加入灭菌甘油至终浓度为20%，液氮速冻存于-80 ℃，此菌液为初级文库菌液。

库容量鉴定：CFU/mL=培养基上的克隆数/50 ?L×稀释倍数×1×103 ?L。

文库总CFU= CFU/mL×文库菌液总体积（mL）。

1. 2. 4 次级文库构建及保存 将验证成功的初级文库加入相应抗性的LB培养基，30 ℃摇床过夜培养，培养结束后抽提质粒，测OD并进行电泳检测。将抽提得到的质粒稀释至300 ng/?L，与pGADT7-DEST载体混合进行LR重组反应，反应产物电转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，将转化的产物接种到新的15 mL离心管，37 ℃、250 r/min摇床中培养1 h;将培养物涂布培养基，从培养基上长出的菌落中随机挑取24个单克隆，进行菌落PCR鉴定，对其插入片段长度和重组率进行分析;在剩余菌液中加入灭菌甘油至终浓度为20%，液氮速冻存于-80 ℃，此菌液为次级文库菌液。

1. 2. 5 酵母双杂交cDNA文库质量鉴定 用5 ?g次级文库质粒转化Y187酵母菌株，在150-mm SD/–Leu培养基上铺100 ?L稀释比例为1∶10、1∶100、1∶1000和1∶10000的稀释液，30 ℃倒置温育培养基直到克隆出现（3～6 d）;收集转化子，确定文库的滴度，并挑取24个克隆，利用T7SP Primer和3' AD Primer进行PCR扩增，电泳检测插入cDNA片段的大小。

1. 2. 6 菌落计数方法 在ImageJ软件中打开图片，转换RGB图像为灰度图片：Image–>Type–>8-bit。阈值选定：Image–>Adjust–>Threshold–>阈值选定->红色代表选中。培养皿边缘高亮部分影响菌落的识别，使用椭圆选框大致选中菌落所在区域。Analyze–>Analyze particles，点击OK，得到菌落计数结果。

2 结果与分析

2. 1 总RNA提取及mRNA分离纯化

为研究葡萄霜霉菌效应蛋白早期抑制葡萄免疫反应过程的机理，利用Spectrum Plant Total RNA Kit分别提取霜霉菌侵染西拉葡萄0、12、18、24和36 h后的叶片总RNA，核酸电泳检测结果（图1）显示，从5个时间点样品提取的总RNA的28S和18S条带均清晰明亮，且完整性较好。将5个样品等量混合后，用NanoDrop 2000和Agilent 2100进行测定，结果显示，混合后的RNA样品浓度为596 ng/?L，A260/A280=2.14，A260/A230=2.13，28S/18S=2.0，RIN=8.4，质量满足试验要求（RIN≥7且28S/18S≥0.7），可进行后续文库建库试验。琼脂糖凝胶电泳检测结果（图2）显示，经Oligotex mRNA Midi Kit分离纯化后的mRNA在≥0.5 kb较大范围内呈弥散状，无明显28S和18S rRNA区带，大部分的mRNA集中在0.5～2.0 kb范围内呈弥散状，mRNA无DNA污染且完整性较好，适用于后续构建文库。

2. 2 初级文库的构建及鉴定

将pDONR222载体与反转录得到的双链cDNA按比例混合进行BP重组反应，转化大肠杆菌DH10B感受态细胞后，得到初级文库。吸取初级文库原液10 ?L稀释100倍，将50 ?L稀释液涂布于LB+Amp的培养基上，ImageJ软件读出的克隆总数为5719个，菌液量为4 mL，根据库容量的计算方法，文库总CFU=5719/50 ?L×100倍×1×103 ?L×4 mL≈4.6×107 CFU（图3），说明本研究构建的库容量较高。在库中随机挑取24个克隆进行菌落PCR鉴定，琼脂糖凝胶电泳检测结果（图4）显示，阳性率为96%，扩增出的插入片段大小不一，分布在750～2000 bp，仅有一个菌落未扩增出条带（白色箭头所示），大多数条带大小集中于1000～2000 bp。综上所述，该cDNA文库的质量和库容量较好，可用于筛选后续效应因子的靶标蛋白。

2. 3 次级文库的构建及质量鉴定

将pGADT7-DEST载体与构建合格的初级文库质粒按比例混合后进行LR反应，重组产物转化大肠杆菌DH10B感受态细胞后得到次级文库菌液。吸取10 ?L细菌原液稀释100倍后，取50 ?L涂布于LB+Amp的培养基上，ImageJ软件读出的克隆数为3352个，根据公式计算次级文库库容量总CFU=3352/50 ?L×100倍× 1×103 ?L×4 mL≈2.7×107 CFU（图5）。在次级文库中随机挑取24个克隆进行PCR检测，琼脂糖凝胶电泳检测结果（图6）显示，阳性重组率为96%，扩增出的插入片段分布在750～2000 bp，主要集中在1000～2000 bp，说明本研究构建的库容量较高。

用5 ?g文库质粒转化Y187酵母菌株，在150-mm SD/–Leu培養基上铺100 ?L稀释比例为1∶10、1∶100、1∶1000和1∶10000的稀释液，30 ℃倒置温育直到克隆出现（3～6 d）（图7）;收集转化子，确定文库的滴度，并挑取24个克隆，利用T7SP Primer和3' AD Primer进行PCR扩增，电泳检测插入cDNA片段的大小（图8），扩增出的插入片段分布在250～2000 bp，主要集中在1000～2000 bp，说明本文库重组的cDNA序列的完整性高，符合酵母双杂交筛选要求。

3 讨论

目前，用于酵母双杂交cDNA文库构建的主流方法有Clonetech的SMART方法和Invitrogen公司基于Gateway技术的方法，近年来上海海科公司还推出了All-Direct方法。Clonetech的SMART方法主要优点在于建库所需的RNA起始量很小，只要几微克即可，成本相对较低。Invitrogen的方法对起始RNA的要求较高，建议起始用量大于200 ?g，不需要PCR扩增，保证了文库基因的覆盖度和真实性;SMART方法不分离mRNA，而Invitrogen的方法在建库过程中会进行mRNA的分级分离，去除文库内核糖体RNA及基因组DNA等对反转录的影响;SMART方法使用酶切连接或酵母细胞内重组的方式，进行片段与载体连接，而Invitrogen使用高效率的Gateway体外重组方式，文库的重组率及原始库容均较高，且得到的文库质粒还可转移到其他任意载体上形成其他用途的文库，既提高了文库的使用率，又扩大了文库的使用范围;SMART方法构建的文库只能采用Mating的方法进行筛库，而Invitrogen的文库既可用共转也可采用Mating的方法。All-Direct方法是在Invitrogen方法的基础上进行进一步优化，只需经过一次重组直接连接到目的载体上，从而极大提高了文库的质量。

为高效率和高质量地筛选互作靶蛋白，构建高质量的酵母双杂交cDNA文库具有必要性。评价一个酵母双杂交cDNA文库是否为高质量主要有两个方面：（1）库容量，是指构建的cDNA文库中所包含的重组子克隆数，其数量反映了一个cDNA文库的覆盖度，理论上一个覆盖度完整的cDNA文库库容量至少有1×106 CFU（李珣等，2016）。本研究构建的初级和次级cDNA文库的库容量分别为4.6×107 CFU和2.7×107 CFU，均达到建库的标准，说明本文库覆盖度完整。（2）基因的重组率和插入片段长度，即重组cDNA序列的完整性（王淑红等，2008）。本研究构建的初级和次级cDNA文库基因重组率均为96%，且插入片段主要集中在1000～2000 bp，说明本文库重组的cDNA序列完整性高。

目前已报道的2个葡萄霜霉菌侵染葡萄叶片cDNA文库均运用SMART方法构建，利用的材料是霜霉菌侵染抗病品种葡萄叶片不同时间点的RNA，主要用于抗病基因的抗病分子机理研究（王沛雅，2008;王沛雅等，2009）。本研究利用Gateway技术构建的酵母双杂交cDNA文库，为筛选霜霉菌致病效应蛋白在寄主体内的靶标打下基础，为今后针对性地设计杀菌药物的靶标提供可行的思路和策略。

4 结论

本研究通过Gateway技术构建了高质量的霜霉菌侵染后葡萄叶片酵母双杂交cDNA文库，在库容量、基因重组率和外源插入片段长度方面均符合cDNA文库构建要求，且该方法得到的文库质粒还可转移到其他任意载体上形成其他用途的文库，简单易行，为筛选霜霉菌致病效应蛋白在寄主体内的靶标提供了材料基础，可用于下一步深入研究葡萄霜霉菌侵染葡萄的具体致病机理。

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（責任编辑 麻小燕）