覃英 韦江璐 陈炯宇 邢永秀 李杨瑞

摘要：【目的】探討环境因子对甘蔗内生成团泛菌（Pantoea agglomerans）XD20生长及促生特性的影响，为该菌的进一步开发应用提供参考。【方法】检测不同pH、氯化钠浓度、重金属、化学试剂及铁离子浓度、碳源、氨基酸及碳氮比对菌株XD20生长、嗜铁性能和溶磷性能的影响，并采用正交设计对碳源、氮源、氯化钠浓度进行优化筛选。【结果】菌株XD20适宜生长的pH在7左右，超过4%的氯化钠浓度会抑制其生长;菌株XD20具有一定的重金属耐受性，可在Mn7+、Cr6+浓度为5～400 mg/L范围内生长;以MSA作为基础培养基，当铁离子浓度为0～10 μmol/L时，该菌的相对嗜铁量随铁离子浓度升高而升高，当铁离子浓度超过10 μmol/L时，其相对嗜铁量含量呈降低趋势。以柠檬酸为碳源、脯氨酸为氮源、碳氮比为3∶1时，有利于菌株XD20嗜铁素的分泌。不同碳源对菌株生长和溶磷性能的影响结果表明，有利于该菌生长的碳源排序为甘油>葡萄糖>柠檬酸>蔗糖>苹果酸;正交试验结果表明，供试菌株XD20生长量最大的碳源、氮源和氯化钠浓度分别为0.1%柠檬酸、0.5 g/L硫酸铵和4%氯化钠;影响供试菌溶磷能力的因子顺序为钠离子浓度>碳源>氮源，菌株XD20溶磷量最大时的培养条件与其生长量最大时的培养条件一致。【结论】甘蔗内生固氮菌株XD20具有较好的环境耐受性，铁离子浓度会影响其生长量和嗜铁量。以柠檬酸为碳源、脯氨酸为氮源、碳氮比为3∶1时，有利于菌株XD20嗜铁素的分泌。0.1%柠檬酸、0.5 g/L硫酸铵和4%氯化钠的培养条件对其生长和溶磷特性的效果最好。

关键词： 成团泛菌XD20;环境因子;溶磷;嗜铁;生长特性

Abstract：【Objective】The effects of environment factors on the growth and growth-promoting characteristics of the endogenous Pantoea agglomerans XD20 from sugarcane were studied to provide a reference for the further development and application of the strain. 【Method】This study tested the growth，siderophore，and phosphorus dissolving capacity of P. agglomerans XD20 under different pH values，sodium chloride concentrations，heavy metals，chemical reagents and iron ion concentrations，carbon sources，exogenous amino acids，and carbon-nitrogen ratios. Orthogonal design was used to optimize the phosphorus dissolving from carbon source，nitrogen source and sodium chloride concentration. 【Result】The suitable pH for the growth of XD20 was about 7. More than 4% sodium chloridecould inhibit the growth of the bacteria. XD20 had a certain tolerance to heavy metals and could grow in the range of Mn7 + and Cr6 + concentration from 5 to 400 mg/L. MSA was used as the basic medium. When the concentration of iron ion was in the range of 0-10 μmol/L， the relative siderophore content of the bacteria increased with the increase of iron ion concentration. However，when the concentration of iron ion was more than 10 μmol/L，the relative siderophore content of the bacteria tended to decrease. When ci-tric acid was added as the carbon source，proline as the nitrogen source，and the ratio of carbon to nitrogen was 3∶1，it was beneficial to the secretion of XD20 siderophore. The effects of different nitrogen sourceson the growth and phosphorus dissolution performance of the strain showed that the suitable carbon source for the growth of the bacteria was glycerol>glucose>citric acid>sucrose>malic acid. The results of the orthogonal test showed that the concentration of carbon source，nitrogen source and sodium chloride with the largest growth of XD20 was 0.1% citric acid，0.5 g/L ammonium sulfate and 4% sodium chloride，respectively. The order of the factors influencing the capacity of phosphate solubilization was sodium ion concentration>carbon source>nitrogen source. The culture conditions of the strain XD20 with the largest phosphate solu-bilization were the same as the largest growth. 【Conclusion】Sugarcane endogenous nitrogen-fixing XD20 has good environmental tolerance， and iron ion concentration can affect its growth and siderophore. When citric acid is used as carbon source， proline as nitrogen source and the ratio of carbon to nitrogen is 3：1， it is beneficial to the siderophore secretion of XD20. The culture conditions of 0.1% citric acid， 0.5 g/L ammonium sulfate and 4% sodium chloride have the best effects on its growth and phosphorus solubility.

0 引言

【研究意义】甘蔗是重要的禾本科糖料作物和可持续生物燃料来源，对氮磷元素的需求量极大（郭家文等，2012）。植物内生菌是指在植物体内生活至少一部分时间，而不会对宿主造成明显伤害的细菌或真菌，具有固氮、促进植物生长、分泌植物激素、抗逆境、促进植物对矿质元素吸收及抗病虫害和逆境等作用（Samuel and Muthukkaruppan，2011）。菌株XD20是本课题组前期从甘蔗中分离获得的成团泛菌（Pantoea agglomerans），具有固氮、产嗜铁素、溶磷、产吲哚乙酸（IAA）等促生特性。接种该菌至不同甘蔗品种，对甘蔗的株高、生物量及叶片的叶绿素含量、谷氨酰胺合成酶活性、硝酸还原酶活性及硝态氮含量均具有促进作用（毛莲英等，2019），表现出较大的应用潜力。因此，明确不同环境因子对菌株XD20生长及促生特性的影响，对综合开发和利用该菌在农业生产中的应用具有重要意义。【前人研究进展】目前在可持续发展农业的大背景下，研发、生产及使用高效稳定的菌肥日趋得到重视。促生细菌促进植物生长的主要机制是基于菌株可促进植株对营养的获取、铁载体生物合成、固氮和激素合成。成团泛菌是产类胡萝卜素的肠杆菌科（Enterobacteria-ceae）泛菌属（Pantoea sp.）细菌，可控制植物病害，产生抗生素，促进植物生长或利用其产微生物絮凝剂处理工业废水，具有广泛的应用价值（杨劲峰，2013;柯红娇等，2014;周小梅等，2016）。但植物内生菌或促生菌对植物的作用受多方面因素的影响，这些因素也必然会影响到菌株作用的发挥。Budzikiewicz（1993）认为培养基的pH影响菌株生长及其嗜铁和溶磷能力。Gray和Smith（2005）研究表明，不同的重金属种类和浓度对菌株的影响存在差异，筛选耐重金属的菌株有利于促进重金属污染的土壤修复，提高修复植物的生物量。Kim等（2005）研究报道，菌株MB14产生最大PO43--P溶解性的生长条件为：以8 g/L葡萄糖和2 g/L蔗糖作为碳源，0.1 g/L精氨酸作为氮源。Yu等（2017）研究表明，葡萄糖、pH和Pb（NO3）2能促进菌株的生长和铁载体的产生。毛莲英等（2019）报道菌株XD20的最适生长温度为30 ℃，在pH近为中性时生长良好，能利用硝态氮和铵态氮，对高糖浓度有较高适应性。【本研究切入点】国内外对促生细菌的研究主要集中于菌株对植株的促生长机制，但对于环境因子对菌株生长和促生性能的研究较少。目前，对影响成团泛菌菌株XD20生长及发挥其促生长特性的因子尚未十分清楚。【拟解决的关键问题】采用单因素和正交试验，探讨不同环境因子对菌株XD20生长和促生特性的影响，为该菌株的进一步开发应用提供参考。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

1. 1. 1 供试菌株 菌株XD20，为本课题组分离保存。

1. 1. 2 供试培养基 Luria-Bertani（LB）培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化钠10 g/L，pH 7.0，固体培养基加入20 g/L琼脂。Pikovaskaias （PKO）培养基：葡萄糖10.0 g，硫酸铵0.5 g，氯化钠 0.2 g，氯化钾0.2 g，七水硫酸镁0.03 g，硫酸锰 0.03 g， 硫酸亚铁0.003 g，酵母膏0.5 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL，pH 6.8～7.0。蔗糖—天冬酰胺（MSA）培养基：蔗糖20.0 g/L，天冬酰氨2.0 g/L，磷酸氢二钾1.0 g/L，七水硫酸镁 0.5 g/L。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 不同pH和氯化钠浓度对菌株XD20生长的影响 配制pH分别为3、5、7、9和氯化钠终浓度为1%、2%、3%、4%、5%的LB液体培养基，30 ℃培养24 h，在波长600 nm处检测菌液的OD600，绘制供试菌的生长曲线（马永强和朱海霞，2019）。

1. 2. 2 不同类型重金属及其浓度对菌株XD20生长的影响 参照徐秀倩等（2019）的方法，配制LB固体培养基，分别添加KMnO4、NiCl2·6H2O、 K2Cr2O7和CuSO4·5H2O，使 Mn7+、Ni2+、Cr6+和Cu2+浓度梯度为 5、10、20、40、80、100、200和400 mg/L，以纯LB培养基为对照，每处理3个重复。将供试菌接种于上述培养基中，30 ℃培养箱恒温培养24 h后观察供試菌生长情况，并记录结果。

1. 2. 3 不同灭菌试剂对菌株XD20生长的影响 制备化学灭菌试剂：0.9%生理盐水，75%乙醇，100%乙醇，0.5%碘酒， 5%苯酚，5%甲醛。圆形滤纸片法：取灭菌的圆形滤纸浸取化学试剂，然后置于涂布接种供试菌的培养皿中，观察化学试剂对菌株的抑菌状况（肖杭等，2010）。

1. 2. 4 菌株XD20氧化酶和过氧化氢酶检测 氧化酶检测：配制1%的四甲基对苯二胺盐酸盐溶液，将灭菌的滤纸置于培养皿中，取培养至中期的菌液在滤纸上划线，若划线部位在10 s左右变为紫色则为阳性反应。过氧化氢酶检测：在过夜培养的菌株XD20菌苔滴加1 mL 3%过氧化氢，观察化学反应，如果10 min内产生气泡，为阳性反应（龚明福等，2009）。

1. 2. 5 不同碳源、氨基酸和铁离子浓度对菌株XD20嗜铁性能的影响 参照赵荣艳等（2013）的方法，选取MSA培养基为基本培养基，单因素试验方法检测碳源、氨基酸和铁离子浓度对供试菌嗜铁性能的影响。碳源试验以柠檬酸、甘油和葡萄糖代替培养基中的碳源蔗糖。氨基酸试验以天冬氨酸、丙氨酸和脯氨酸代替培养基中的氮源天冬酰胺。以柠檬酸和脯氨酸作为碳源和氮源，设置碳氮比分别为3∶1、5∶1、8∶1、10∶1、13∶1和15∶1，1%接种量接种供试菌株，检测不同碳氮比对供试菌的生长和嗜铁性能的影响。配置50 mmol/L FeCl3母液，过滤除菌后加入MSA培养基中，使铁离子终浓度分别为0、1、10和20 μmol/L，1%接种量接种供试菌株，检测不同铁离子浓度对供试菌嗜铁性能的影响。

1. 2. 6 不同碳源、氮源和氯化钠浓度对菌株XD20 溶磷性能的影响 参照冯瑞章等（2009）的方法，分别配制浓度为1%的柠檬酸、甘油、苹果酸、蔗糖、葡萄糖作为不同碳源的培养基，采用3因素3水平正交设计，以碳源、氮源和氯化钠浓度为变化因素，每因素取3水平，碳源3水平分别为1%的葡萄糖、柠檬酸和甘油;氮源3水平分别为终浓度为0.5 g/L的硫酸铵、硝酸铵和硝酸钠;氯化钠浓度3水平分别为2%、3%和4%的氯化钠。测定不同碳源对固氮菌生长量的影响。溶磷性能测定采用PKO液体培养基（pH 7.0），培养7 d后采用钼锑抗试剂法测定磷含量，以OD600表示菌株的生长情况。

1. 3 统计分析

利用SPSS 21.0进行试验数据处理及差异显著性分析，利用Excel 2010制图。

2 结果与分析

2. 1 不同pH和氯化钠浓度对菌株XD20生长的影响

以OD600为菌株生长量评价指标。由图1可看出，pH在3～9时，菌株XD20的OD600随pH的升高呈先上升后下降的变化趋势，在pH为7时菌株OD600达最大值，表明供试菌适宜生长的pH在7左右;而pH过低（3）或过高（9）时，OD600不足0.10且二者显著不差异（P>0.05，下同），表明菌株均无法正常生长。盐耐受性结果（图2）显示，氯化钠浓度为1%～4%时，随氯化钠浓度升高，菌株XD20的OD600增加，当氯化钠浓度超过4%后，菌株的OD600出现下降趋势，其中1%处理的菌株OD600显著低于其他浓度处理（P<0.05，下同），其他浓度处理菌株的OD600无显著差异。因此，该供试菌适宜生长的pH在7左右，较适宜生长的氯化钠浓度为4%左右，过高的渗透压对菌株的生长有抑制作用。

2. 2 不同类型重金属及其浓度对菌株XD20生长的影响

由表1可知，供试菌对Mn7+和Cr6+的耐受性较高，在浓度为5～400 mg/L时均可生长，而在Ni2+终浓度为100 mg/L及以上和Cu2+终浓度为200 mg/L及以上的培养基中均无法生长。说明菌株XD20对Mn7+和Cr6+具有较好的耐受性，但对重金属Ni2+和Cu2+的耐受性相对较差。

2. 3 不同灭菌试剂对菌株XD20生長的影响

不同灭菌试剂对菌株生长影响的试验结果（图3）显示，0.9%生理盐水、75%乙醇和100%乙醇处理的培养基中未出现抑菌圈;0.5%碘酒、5%苯酚和5%甲醛处理的培养基中出现明显的抑菌圈。可见，该菌对0.9%生理盐水、70%乙醇和100%乙醇有一定的耐受性，对0.5%碘酒、5%苯酚和5%甲醛无耐受性。

2. 4 菌株XD20氧化酶和过氧化氢酶检测结果

用1%四甲基对苯二胺盐酸盐溶液检测固氮菌XD20的氧化酶，未出现紫色反应，但在新鲜菌苔滴加过氧化氢，出现了明显的气泡反应，表明该菌株具备产生过氧化氢酶的能力，不具备产生过氧化物酶的能力。说明该供试菌株具有为植物消除过氧化氢的潜力。

2. 5 不同碳源、氨基酸和铁离子浓度对菌株XD20嗜铁性能的影响

碳源检测供试菌相对嗜铁量的结果（图4）表明，柠檬酸能显著增加菌株XD20的相对嗜铁量，其次是甘油和葡萄糖，蔗糖作为碳源的相对嗜铁量最低。不同氨基酸对菌株相对嗜铁量影响的试验结果（图5）表明，脯氨酸对菌株XD20嗜铁素分泌的增强效果最显著，其次是丙氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺，且各处理间均差异显著。不同碳氮比对菌株相对嗜铁量影响的结果（图6）表明，相对嗜铁量随碳氮比升高呈波动变化，碳氮比为3∶1时，菌株XD20分泌嗜铁素最多，其次为碳氮比15∶1和10∶1处理。不同浓度铁离子对菌株XD20相对嗜铁量的影响结果（图7）表明，在铁离子浓度为0～10 μmol/L范围内，随着培养基中铁离子浓度的增加，菌株的相对嗜铁量也逐渐增加;当铁离子浓度增加至20 μmol/L时，相对嗜铁量有所降低。说明在一定浓度的铁离子范围内，有助于供试菌株嗜铁素的分泌。

2. 6 不同碳源、氮源和氯化钠浓度对菌株XD20溶磷性能的影响

由图8可看出，供试菌株在以甘油为碳源的培养基中的生长量最大，其次是葡萄糖、柠檬酸、蔗糖和苹果酸。根据碳源对固氮菌生长的影响结果，选择碳源（葡萄糖、柠檬酸和甘油）、氮源（硫酸铵、硝酸铵和硝酸钠）和氯化钠浓度（2%、3%和4%）设计L9（34）3因素3水平正交试验（表2），结果表明，供试菌株XD20生长量最大的碳源、氮源和氯化钠浓度分别为柠檬酸、硫酸铵、4%氯化钠（图9）;影响供试菌溶磷能力的因子排序为氯化钠浓度>碳源>氮源（表3）;菌株XD20溶磷量最大时的培养条件为1%柠檬酸，0.5 g/L硫酸铵，4%氯化钠（图9）。

3 讨论

化肥及农药的长期大量使用对土壤及农业生态造成严重破坏，而生物肥料和生物杀虫剂作为化学肥料的替代品之一，具有使传统农业保持高生产率和促进农业可持续发展的潜能（Tilmann et al.，2002）。内生菌促进植物生长的机制可分为直接作用和间接作用，直接作用主要包括固氮、溶磷、嗜铁及产生植物激素等促进植物生长或改变根际土壤中无效元素的形态使其成为适合植物吸收的元素形态，进而提高植物对土壤中营养元素的吸收（Bhattacharyya and Jha，2012;Geddes et al.，2019）;间接作用主要是对病原体和或非生物胁迫具有一定的抵抗力（Beneduzi et al.，2012）。冯瑞章等（2006）研究表明，土壤中施入的磷肥主要以无效态形式存在，当季施入的磷肥利用率一般只有5%～10%。溶磷菌具有溶解难溶性磷酸盐的能力，但其溶磷能力的强弱受菌株遗传特性和生长环境的影响。微生物通过分泌嗜铁素，高亲和力螯合环境中的铁离子，不仅可满足微生物自身生长的需要，增强宿主植物对铁的吸收，降低环境中的铁离子，还可增强促生菌在相关生态位的竞争力，抑制有害细菌和真菌的生长（张璐，2014）。菌株XD20是从甘蔗根部分离出的具有较好固氮作用的固氮成团泛菌，同时具有溶磷、分泌铁载体和植物激素等多种促生长特性，具有较好的应用潜力（毛莲英等，2019）。

影响微生物肥料肥效发挥、生长和促生特性的环境因子很多，主要包括pH、温度、碳源、氮源、盐浓度、重金属等，不同微生物对不同环境因子的选择适应性存在差异（Ramos et al.，2001）。本研究结果显示，该菌适宜生长的pH为7，氯化钠浓度在4%左右。微生物通过合成天然金属螯合剂（如柠檬酸的代谢途径），提高植物体对金属的吸收和利用，或通过隔离系统减少重金属对植物的毒害作用，加强金属离子向地上部分的迁移和转移（李瑞等，2014）。马莹等（2013）研究表明，微生物可激活植物抗氧化酶活性，分泌高亲和力的铁载体，增加根际铁的供应，竞争性地抑制根对重金属元素的吸收，改变植物对重金属的吸收、转运和细胞内分布，抑制重金属元素向地上部分转移，提高作物产量。本研究结果显示，菌株XD20具有一定的重金属耐受性，特别是在Mn7+、Cr6+浓度为5～400 mg/L时均可生长，显示出其对重金属土壤污染修复的潜力;同时该菌还具有产生过氧化氢酶的能力，对渗透压和多个化学试剂的耐受性也较好。过氧化氢酶是一种常见的影响土壤肥力的功能酶，在污染土壤尤其是酸化土壤中该酶的活性降低会对植物的生长产生不利影响。土壤过氧化氢酶活性的增强与土壤有机物质的增加有关，而有机物质的增加与土壤微生物有直接关联（Benitez et al.，2005）。该菌具有过氧化氢酶活性，且耐受性响度较好，是否有可能作为一种生物肥料补充酸化土壤中过氧化氢的缺乏还有待进一步研究，同时该菌是否可作为一种潜在的土壤修复菌株也值得进一步研究。

植物促生细菌促进植物生长的机制之一是菌株可分泌嗜铁素，溶解无机磷。了解影响菌株分泌嗜铁素和溶磷的因素，对充分发挥菌株的促生作用具有重要意义。铁载体的合成依赖于环境因子、营养因素及这些因素间的相互作用（杨岑等，2010;张飞官等，2013;Yu et al.，2017）。本研究中不同的铁离子浓度、碳源、氨基酸和碳氮比对菌株XD20嗜铁性能影响的结果显示，在铁离子浓度为0～10 μmol/L时，随着培养基中铁离子浓度的增加，该菌株的相对嗜铁量逐渐增加，当铁离子浓度超过10 μmol/L时，供试菌株的相对嗜铁量呈降低趋势;柠檬酸为碳源和脯氨酸为氮源能显著增加菌株XD20的相对嗜铁量;当碳氮比为3∶1时，菌株XD20嗜铁素的分泌最多。可见，碳氮比会影响微生物铁载体获取铁的能力，土壤中的碳氮比也必然会影响微生物发挥其分泌铁载体的能力。溶磷菌具有溶解难溶性磷酸盐的能力，但其溶磷能力的强弱受菌株遗传特性和生长环境的影响。本研究中不同碳源、氮源和氯化钠浓度对该菌溶磷性能影响的结果显示，供试菌株XD20以柠檬酸为碳源时最适合该菌的生长，影响该菌生长量的碳源、氮源和氯化钠浓度排序为氮源>碳源>氯化钠浓度;适合菌株XD20溶磷的培养条件的碳源、氮源和氯化钠浓度分别为柠檬酸、硫酸铵和4%氯化钠。El-Badry等（2016）研究证明，细菌溶磷最佳条件为改良PVK培养基培养3 d，以草酸铵为氮源，葡萄糖为碳源，初始pH为7。这些结果表明碳源和氮源均会影响菌株的分泌铁载体和溶磷特性，不同来源菌株适宜的发酵环境存在差异，这不仅与菌株本身所处的环境相关，还可能与菌株自身的遗传特征及来源有关。目前成团泛菌属已从水稻、棉花、甘蔗等作物中分离出来，且不同种类的菌株在促进植物生长及提高抗逆性方面已有初步研究（沈德龙等，2002;劉雅琴等，2008;张晓宇等，2017）。本研究初步探讨了菌株XD20溶磷和嗜铁的影响因子，可为该菌开发为微生物肥料及其肥效发挥提供参考。但外界环境对菌株的影响具有不可控性，以及试验未考虑更加完善的交互作用及发酵成本，因此试验结果对菌株的培养应用条件还需进一步完善，也需深入研究菌株对环境的响应机制。

4 结论

甘蔗内生固氮菌株XD20具有较好的环境耐受性，铁离子浓度会影响其生长量和嗜铁量。以柠檬酸为碳源、脯氨酸为氮源、碳氮比为3∶1时，有利于菌株XD20嗜铁素的分泌。0.1%柠檬酸、0.5 g/L硫酸铵和浓度为4%氯化钠的培养条件对其生长和溶磷特性的效果最好。

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（責任编辑 王 晖）