吴艳玲，谢玉华，李升锦(重庆医科大学附属第二医院呼吸科，重庆 400010)

结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)引起的慢性传染性疾病。结核病的确诊是基于病原体的检测，依赖于测量样本中的病原体负荷量。由于临床上难以获得MTB检测样本，并且受样本中MTB分布不可预测的影响，结核病的诊断显得比较困难，尤其是肺外结核和涂片阴性的肺结核[1]。因此，探索一种高敏感性和特异性的血清学结核感染标志物对结核病的诊断具有重要的临床价值。

微小RNA(microRNA，miRNA)是由22～24个核苷酸组成的在翻译水平调控真核细胞基因表达的非编码小分子RNA，约60%的人类转录基因组可能受miRNA调控[2]。目前研究认为循环miRNA与结核病的发生、发展有密切联系，并被证实可以作为诊断活动性结核病的潜在生物标志物[3]，但目前对于其诊断准确性尚无统一结论。故本研究采用荟萃(meta)分析方法作出定量的合并，从而客观评估循环miRNA对活动性结核病的诊断效能。

1 资料与方法

1.1资料来源 计算机检索PubMed、Web of Science、Embase、中国知网(CNKI)、中国生物医学文献数据库(CBM)、万方数据库和维普数据库(VIP)，搜集循环miRNA与活动性结核病相关性的研究，检索时间从建库至2019年4月。此外，追溯纳入研究的参考文献，以补充获取相关文献。英文检索词包括：tuberculosis、mycobacterium terberculosis、Koch′s disease、microRNA、microRNAs、miRNA、miRNAs。中文检索词包括：结核、结核病、肺结核、微小RNA。

纳入标准：(1)研究类型为病例对照研究；(2)研究对象为人类；(3)样本来源为外周血；(4)研究对象来源于临床确诊的活动性结核病患者和排除活动性结核病的对照组；(5)文献明确阐明是研究循环miRNA与活动性结核病诊断的关系，并能完整提取四格表数据。

排除标准：(1)非中、英文文献；(2)重复发表的文献；(3)研究对象为细胞系、动物；(4)样本来源为组织或其他体液的miRNA；(5)综述、病例报告、会议记录、毕业论文；(6)无法获取全文,缺乏原始数据或其他关键信息。

1.2资料提取、文献质量评价与偏倚风险评价 由2名研究者独立进行文献检索并根据纳入和排除标准进行筛选，再仔细阅读全文，对入选的文献提取以下相关资料：第一作者、发表年限、国家、年龄、样本量、样本来源、miRNA、结核病类型、对照人群、检测方法、四格表数据、敏感性、特异性、ROC曲线下面积。根据QUADAS-2标准对纳入的文献进行质量评价。在文献筛选、数据提取及质量评价过程中，如遇分歧与第三位研究者协商解决[4]。

1.3统计学分析 利用Revman 5.3对文献质量进行评价，利用Stata 15.0对所获取的数据进行meta分析和异质性分析。纳入研究通过Q检验判断是否存在异质性，检验水准设为0.05，同时结合I2定量判断异质性的大小。若P>0.05或I2≤50%，说明纳入研究间异质性较小，可以采用固定效应模型；若P≤0.05或I2>50%，说明纳入研究间异质性较显著，则运用随机效应模型,并分析异质性来源。通过Spearman相关系数确定纳入研究之间是否存在阈值效应。Spearman相关分析显示P>0.05，说明不存在阈值效应引起的异质性。通过meta回归分析、亚组分析和敏感性分析探索与阈值效应无关的异质性来源。计算纳入文献的合并敏感性(Sen)、特异性(Spe)、阳性似然比(PLR)、阴性似然比(NLR)以及诊断比值比(DOR)等指标，并绘制SROC曲线，计算曲线下面积(AUC)，AUC越接近1，表示其准确价值越高。所有合并结果都以合并值和95%CI表示。利用Stata 15.0软件作Deeks漏斗图评估是否存在发表偏倚。

2 结果

2.1文献筛选流程及结果 初检出相关文献1 600篇，根据文献排除标准排除文献1 579篇，最终纳入21项研究[5-25]。文献筛选流程及结果见图1。

2.2纳入研究的基本特征及质量评价 共纳入2 373例研究对象，其中病例1 142例，对照1 231例。纳入研究的基本特征见表1。利用QUADAS-2所作出的文献质量评价结果见图2。

表1 纳入研究的基本特征

续表

2.3meta分析结果

2.3.1循环miRNA诊断活动性结核病的准确性 Spearman相关系数计算结果显示r=0.48、P=0.23，提示纳入文献不存在阈值效应。异质性检验结果发现研究间异质性较大，采用随机效应模型进行meta分析。结果显示：合并敏感性为0.85(95%CI：0.78～0.89)，合并特异性为0.85(95%CI：0.81～0.88)，PLR为5.49(95%CI：4.21～7.15)，NLR为0.18(95%CI：0.13～0.26)，DOR为30.06(95%CI：16.88～53.52)，SROC曲线AUC为0.91(95%CI：0.88～0.93)。见图3。

2.3.2meta回归分析与亚组分析 利用meta回归分析和亚组分析探索非阈值效应引起的异质性来源。通过单变量meta回归分析，纳入文献的异质性可能来源于研究国家、对照人群类型、样本量大小，见图4。按对照人群类型、病例组样本量大小、年龄阶段及miRNA类型进行亚组分析，分析结果见表2。结果表明，以非单一健康人作为对照人群的研究DOR显著升高，敏感性轻度升高，说明以非单一健康人作为对照组时能更好保证诊断准确性。相较于成人，儿童miRNA对活动性结核病诊断价值更高。与其他miRNA相比，miR-29和miR-155作为诊断标志物的研究较多，且miR-155的诊断价值较miR-29更大。亚组分析结果证实对照人群类型、病例数的大小、人群年龄阶段是引起异质性的重要原因。

表2 亚组分析

2.3.3敏感性分析 由于仅有2篇[5，12]文献出自中国以外的国家，无法计算合并灵敏度、特异度等指标，所以通过敏感性分析进一步追溯异质性来源。此外，如二元箱线图(图5)所示，即4篇[12，16-17，23]文献的5组研究数据未定位于箱线图中，提示该4篇文献可能是异质性来源。逐一剔除单个研究后，对其余研究重新进行meta分析，汇总结果见表3。分别剔除上述文献后，合并的诊断比值比、灵敏度与特异度未见明显变化，说明meta分析结果较稳定。

表3 敏感性分析

2.3.4发表偏倚分析 使用Stata 15.0制作Deeks漏斗图，结果显示t=-1.61，P>|t|=0.118，提示不存在发表偏倚。见图6。

3 讨论

miRNA主要在转录后水平调控靶基因，与mRNA结合从而阻断蛋白质编码基因表达，在基因表达、细胞发育、免疫调节、肿瘤发生等多种生命过程中发挥重要作用。miRNA不仅广泛存在于人体组织和细胞中，通过与Argonaute蛋白结合而避免被RNA酶降解，也稳定地表达于血浆、血清和其他体液中，这种稳定性使miRNA可能成为疾病诊断的生物标志物[26]。目前miRNA在各种恶性肿瘤、脓毒血症、结核病的早期诊断价值已备受关注[27-31]。Fu等[32]在肺结核患者血清中检测1 223种miRNA，与健康人群相比，发现92个miRNA被调节，其中59个上调，33个下调。经文献检索发现，国内外已有不少研究探索循环miRNA对活动性结核病的诊断价值，但多为小样本病例-对照研究，缺乏系统而定量的分析。

本文系统地回顾近年来miRNA用于活动性结核病的临床研究，并采用meta分析方法，克服单个研究样本量小等不足，客观地评估循环miRNA对诊断活动性结核的价值。本研究结果显示,循环miRNA诊断活动性结核病的Sen、Spe、DOR、AUC分别为85%、85%、30.06、0.91，具有较高诊断价值，加之其检测相对无创，可作为一种协同诊断方法。目前临床常用皮肤结核菌素试验(tuberculin skin test，TST)和γ-干扰素释放试验(interferon-gamma release assay，IGRAs)作为结核感染的辅助诊断试验，但有研究报道两者对成人活动性肺结核的诊断效能均较低而不足为临床诊断提供强有力的证据[33]。而本研究发现循环miRNA的PLR和NLR分别为5.49和0.18，提示阳性结果及阴性结果均有较高准确性。

本研究通过meta回归分析和亚组分析，提示对照人群类型、病例组样本量大小、年龄阶段是导致异质性的主要原因。亚组分析得出儿童循环miRNA对活动性结核病的诊断效能优于成人，这可能与儿童免疫状态与成人存在较大差异所致。在所有研究的miRNA中，miR-29和miR-155单独诊断活动性结核病时有较高敏感性及特异性，miR-155诊断活动性结核病的DOR和AUC分别为26.88和0.90，其诊断效能高于miR-29。由于纳入文献不足，本研究尚未对结核分枝杆菌肺内或肺外感染、涂片阴性或阳性的病例作进一步分析。但Pan等[11]发现结核性脑膜炎患儿循环miR-29a较健康儿童明显升高，与柴璐璐[34]研究结果相似。李佩明[35]研究发现循环miR-19a-3p可能成为脊柱结核早期诊断标记物之一，其可能通过调节肿瘤坏死因子的表达参与脊柱结核的病理过程。3篇文献[14，23，25]报道了miRNA的表达在涂片阴性与阳性活动性结核病患者之间的差别，均提示涂片阳性的患者循环miRNA较对照组差异更大，可能有更高诊断效能。

本研究的局限性：(1)病例组并未全部获得病原学证据；(2)纳入文献仅有英语、汉语，可能存在语言偏倚；(3)纳入研究大多数为中国地区，代表性不高，因此该结果外推到其他地区人群时要谨慎。

综上所述，本研究证明循环miRNA可作为活动性结核病的潜在诊断标志物，但受纳入文献质量和数量等限制，尚需要进一步大规模高质量研究予以验证，以促进未来应用于临床诊断。