王绪山，王敏，李静，陈开勇(灌云县人民医院检验科，江苏灌云222200)

慢性炎症是类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)重要的发病机制，关节腔中浸润大量单核细胞等炎性细胞，导致患者关节腔滑膜异常增生、软骨和骨质破坏[1]。基于细胞表面CD14和CD16的表达情况，人类单核细胞可分为CD14++CD16-经典型、CD14+CD16+中间型和CD14lowCD16++非经典型，中间型和非经典型亚群被认为在RA等多种炎症、自身免疫病中发挥重要作用[2-3]。单核细胞表面表达Toll样受体9(Toll like receptor-9，TLR9)，通过识别细菌/病毒等DNA的非甲基化胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(CPG)、真核细胞线粒体DNA等配体，诱导单核细胞分泌炎性因子和趋化因子，发挥固有免疫应答的作用[4]。但TLR9在单核细胞亚群中的表达及其在RA疾病中的作用目前尚不明确。本研究通过流式细胞术检测RA患者外周血单核细胞TLR9表达，并通过非甲基化CPG活化TLR9，分析单核细胞分泌炎性细胞因子的变化，探讨单核细胞TLR9在RA疾病中的作用。

1 材料与方法

1.1研究对象 选择2018年1月—2019年2月在灌云县人民医院骨科就诊的活动性中重度RA患者32例，作为RA组，年龄(48.7±12.5)岁，男6例，女26例；纳入标准：符合2010年美国风湿病学会/欧洲风湿病联盟分类标准，未接受甲氨蝶呤或生物制剂治疗，DAS28-ESR疾病活动评分≥3.2分，3.2分0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准(批准号2017-04)，参加者知情同意。

1.2仪器和试剂 Calibur流式细胞分析仪(美国BD公司)，Luminex 200液相芯片检测系统(R&D公司)，特定蛋白仪(德灵公司)；异硫氰酸荧光素(FITC)-鼠抗人CD14单克隆抗体(mAb)、别藻青蛋白(APC)-鼠抗人TLR9 mAb、percpcy5.5-鼠抗人CD16 mAb及同型对照和红细胞裂解液(BD Biosciences公司)，Ficoll-HyPaque分离液(上海西糖生物公司)，RPMI-1640完全培养液(美国Gibco公司)，非甲基化全链硫代修饰CpG-ODN 2006(上海生工公司)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、单核细胞趋化蛋白(MCP)-1和白细胞介素(IL)-6检测试剂(美国Bio-Rad公司)。

1.3方法

1.3.1标本采集 在空腹状态下抽取健康人对照者和RA患者静脉血6 mL置于肝素钠抗凝管中，其中1 mL用于流式细胞检测，其余5 mL用于分离单核细胞。RA患者有9例有关节腔积液，治疗前抽取积液4 mL，采用Ficoll密度梯度法分离积液单个核细胞，并用500 μL PBS重悬，用于流式细胞分析。

1.3.2流式细胞术检测单核细胞亚群及其表面TLR9 取肝素抗凝静脉血100 μL或PBS重悬的关节腔积液单个核细胞100 μL，加入10 μL FITC-鼠抗人CD14 mAb、10 μL percpcy5.5-鼠抗人CD16 mAb，避光反应30 min，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入0.1%皂素500 μL破膜20 min。1 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入10 μL APC-鼠抗人TLR9 mAb，避光反应30 min，然后加入500 μL红细胞裂解液，避光反应8 min，PBS洗涤后用400 μL PBS重悬，上流式分析仪检测。根据前向散射光和侧向散射光，外周血以单核细胞设门(关节液中细胞分散，以所有的细胞设门)，检测CD14++CD16-经典型、CD14+CD16+中间型和CD14lowCD16++非经典型细胞比例，并检测各亚群细胞表面TLR9平均荧光强度(mean fluorescence intensity，MFI)。

1.3.3单核细胞分离和培养 采用Ficoll密度梯度法分离来自健康人志愿者和RA患者的外周血单个核细胞，用RPMI-1640完全培养液(含10%小牛血清、100 U/L链霉素、100 U/L青霉素)重悬，在24孔细胞培养板中贴壁2 h后，去除非贴壁细胞，加入RPMI-1640培养液继续培养4 h，收集单核细胞，取100 μL单核细胞，加入10 μL FITC-鼠抗人CD14 mAb，避光反应20 min，PBS洗涤后用400 μL PBS重悬，流式分析仪检测CD14阳性细胞比例，结果显示纯度>95%。

1.3.4细胞因子IL-6、TNF-α、MCP-1浓度检测 上述单核细胞经RPMI-1640培养液重悬，调整细胞浓度为1×104cells/mL，培养于24孔板，分2孔，其中1孔加入40 μg/mL CpG-ODN 2006，另1孔为空白对照,置于37 ℃、5%CO2培养箱培养48 h，收集上清液，储存于-80 ℃。用Luminex 200液相芯片检测上清液细胞因子IL-6、TNF-α、MCP-1浓度：取96孔板，每孔加50 μL交联待检细胞因子mAb的磁球，平放在磁铁板上5 min后弃上清液，然后每孔加50 μL样本和标准品，室温下振荡反应30 min，弃上清液，每孔加入亲和素标记的二抗25 μL，室温反应30 min，最后每孔加入50 μL PE标记的生物素，室温静置10 min后洗涤，Luminex 200检测系统检测样本的荧光强度，根据标准品的荧光强度计算各样本细胞因子浓度。每个样本检测3次，取均值。IL-6、TNF-α、MCP-1检测限分别为1.5 pg/mL、1.8 pg/mL和2.0 pg/mL。

2 结果

2.1RA患者外周血单核细胞亚群比例 以单核细胞设门(见图1A)，根据CD14和CD16表达检测单核细胞亚群(见图1B)。与HC组相比，RA患者经典型单核细胞比例显著降低，中间型和非经典型单核细胞比例均显著上升，差异有统计学意义(P<0.05)，结果见表1。

表1 外周血单核细胞亚群比例比较

2.2RA患者外周血单核细胞TLR9 MFI检测 与HC组相比，RA患者外周血3个单核细胞亚群TLR9 MFI均显著上升，差异有统计学意义(P<0.05)，结果见图2、表2。

表2 外周血单核细胞亚群中TLR9平均荧光强度比较

2.3不同活动度RA患者外周血单核细胞亚群TLR9 MFI比较 高疾病活动度组与中疾病活动度组相比，单核细胞亚群TLR9 MFI表达均显著上升，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 不同活动度RA患者外周血单核细胞亚群TLR9 MFI

2.4RA患者关节腔积液单核细胞TLR9检测 RA患者关节腔积液单核细胞亚群比例分别为：经典型(60.6±9.1)%、中间型(31.1±6.4)%、非经典型(8.7±2.3)%；TLR9 MFI分别为：经典型309.6±32.4、中间型461.2±26.5、非经典型288.5±25.4。

2.5CPG活化的外周血单核细胞培养上清液细胞因子检测 与HC组活化后相比，RA患者组活化后上清液细胞因子浓度均显著上升，差异有统计学意义(P<0.05)；与活化前相比，HC和RA组活化后上清液细胞因子浓度均显著上升，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 CPG活化的单核细胞培养上清液细胞因子水平(pg/mL)

3 讨论

人类单核细胞CD14++CD16-经典型可产生高水平的活性氧(ROS)、IL-6和IL-8，迅速募集到炎症部位，吞噬清除病原体[6]；CD14+CD16+中间型高表达HLA-DR，产生更高水平的活性氮物质(RNS)、IL-1β和TNF-α；而CD14dimCD16+非经典型参与巡逻血管内皮细胞对病毒和免疫复合物的反应[7]。早期研究表明RA患者外周血中CD14dimCD16+非经典型单核细胞增加[8]，而最近研究表明外周血中CD14+CD16+中间型亚群的频率增加[9-10]，且与疾病的严重程度显著相关。本研究结果表明RA患者外周血经典型亚群显著降低，中间型和非经典型显著上升。本研究还发现RA患者关节腔积液中存在较多的单核细胞，且中间型亚群比例高于外周血，表明这些细胞不断向炎症组织募集，参与参与关节腔炎症反应。

Kyburz等[11]研究表明TLR9信号传导抑制剂羟氯喹可抑制RA炎症的严重程度，其显著的治疗效果表明TLR9参与RA疾病过程。本研究在外周血和关节腔积液3个单核细胞亚群中均检测到TLR9的高表达，且高疾病活动度患者TLR9表达更显著，突显了单核细胞TLR9在RA疾病中的潜在作用。

RA患者血液中死亡细胞释放的含有非甲基化CpG重复序列的线粒体DNA、细菌/病毒等病原体DNA的非甲基化的CpG寡核苷酸均可作为TLR9内源性配体，活化激活丝裂原活化蛋白激酶p38和NF-κB信号通路，诱导细胞的固有免疫应答[12]。本研究证实，单核细胞经TLR9配体CpG-ODN 2006刺激后可分泌高浓度的IL-6、TNF-α和MCP-1。促炎细胞因子IL-6和TNF-α可刺激软骨细胞、破骨细胞、血管内皮、淋巴细胞、NK细胞和成纤维细胞的活化，从而直接介导滑膜增殖和损伤，并产生降解关节软骨基质的基质金属蛋白酶(MMP)，导致RA中的骨吸收[13]。MCP-1是一种高效的趋化因子，参与炎症单核细胞的募集。以上结果表明，RA患者单核细胞高水平的TLR9参与促炎细胞因子或趋化因子IL-6、TNF-α和MCP-1的产生，参加RA疾病发展。

综上所述，活动性RA患者关节腔积液中存在高比例的中间型和非经典型单核细胞。另外，RA患者外周血单核细胞3个亚群均具有高水平的TLR9，TLR9激动剂增加炎性细胞因子和趋化因子的产生。因此，单核细胞TLR9在RA患者的疾病过程中发挥重要作用。本研究的局限性是对总体细胞的细胞因子分泌进行检测，未对单核细胞亚群进行分选，分析亚群中的功能。因此，单核细胞亚群TLR9在RA疾病中的作用需要进一步深入研究。