许德英，孙真真，王小利，吴玉丹，白娇红，常永超

(河南科技大学第一附属医院 检验科，河南科技大学临床医学院，河南 洛阳471023)

多发性骨髓瘤(MM)是仅次于淋巴瘤的第二大血液系统恶性肿瘤，其发病率为13%，占所有肿瘤的1-1.4%[1]。MM是一种难以治愈的疾病，发病机制复杂，不同患者间的预后差别特别大。关于MM的发病机制[2]，目前的研究认为是因为淋巴细胞表型和功能异常，从而引起免疫监视功能异常，导致机体对恶性肿瘤细胞清除能力下降。而最近的研究发现中性粒细胞与淋巴细胞比值(NLR)在大多数肿瘤中包括多发性骨髓瘤，可以作为无进展生存和总存活数的预测因子[3,4]。Qiang Z等[4]的研究报告证明NLR可以作为MM的一个预后生物标志物，对MM患者的有效治疗提供帮助。较高的NLR提示MM患者预后不良，但具体机制尚不明确[5,6]。本研究旨在分析NLR、淋巴细胞亚群及免疫表型表达对MM患者OS的影响，探索NLR 升高对MM患者预后不良的可能机制。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取2015 年 1 月至 2019 年 1 月河南科技大学第一附属医院收治的初诊 MM 患者共计95 例，所有入选患者诊断均符合张之南主编的第3版《血液病诊断及疗效标准》[7]。纳入研究的病例均无活动性感染、其他系统肿瘤及自身免疫性疾病。其中女37例，男58例。中位年龄63岁(41-89岁)。血清免疫固定电泳分型：IgG阳性67例(70.53%)，IgA阳性14例(14.74%)，IgM阳性1例(1.05%)，IgD阳性1例(1.05%)；Kappa轻链阳性5例(5.26%)、Lambda轻链阳性7例(7.37%)。ISS分期：Ⅰ期22例(23.16%)，Ⅱ期23例(24.21%)，Ⅲ期50例(52.63%)。所有纳入研究的患者诊断、治疗、随访均在河南科技大学第一附属医院完成。研究对象均知情同意。

1.2 主要试剂和仪器

鼠抗人单克隆抗体 CD45-PercP、CD38-PE、CD19-PE、CD56-PE、CD138-APC、CD20-APC、CD117-PE、CD33-APC、CD71-FITC、CD3-FITC/ CD16+CD56-PE/CD45- PercP/CD19-APC、CD3-FITC/CD8-PE/CD4-APC/CD45- PercP与阴性对照抗体小鼠IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1- PercP、IgG1- APC、溶血素、BD Truecount tube绝对计数管(包含数量已知的Beads)、和FACS Calibur流式细胞仪均购自美国Becton Dickinson公司。Kappa-FITC/Lambda-RPE购自丹麦Dako公司。全自动血液细胞分析仪(BC-6800)购自中国迈瑞公司。

1.3 实验方法

患者于入院当日采集空腹抗凝肘静脉血2 ml，用于测定全血细胞计数和淋巴细胞亚群分析。根据患者全血细胞计数结果，计算NLR。95例患者外周血NLR为2.80±3.23，以NLR均值2.80为分界点将患者分为高NLR组(NLR≥2.80)29例和低NLR组(NLR<2.80)66例。

1.4 淋巴细胞亚群检测

在BD计数管中加入7 μl四色荧光试剂(CD3-FITC/ CD8-PE/CD4-APC/CD45- PercP，CD3-FITC/CD16+CD56-PE/CD45- PercP/CD19-APC)和30 μl全血，充分混匀后避光室温孵育30 min，加入1×溶血素400 μl,充分混匀后室温避光孵育10 min，24 h内上机检测。应用FAcsCalibur四色流式细胞仪进行检测，MultiSET软件进行数据分析，每个样本测定管获取淋巴细胞数10000个。淋巴细胞亚群绝对计数将BD计数管换成BD Truecount tube绝对计数管，方法同上。在前向散射角(FSC)和侧向散射角(SSC)散点图上选定淋巴细胞群，分析MM患者外周血CD3、CD4、CD8、CD56、CD19的表达情况。

1.5 流式免疫表型检测和分析

无菌操作取0.2 ml骨髓液进行涂片。骨髓涂片采用瑞氏染色，显微镜下观察并分类计数200个有核细胞。另取2-4 ml骨髓液肝素抗凝，用四色流式细胞仪CellQuest软件获取每管至少分析30000个细胞，通过CD38/CD138设门圈定待检细胞群，所有抗原表达分析均是针对 CD38++/CD138+ 细胞。阳性水平根据FITC-/PE-/Per-CP/APC-自发荧光范围确定。流式细胞术检测结果以荧光强度<102为阴性，102-103为弱阳性，103-104为强阳性，膜抗原≥20%定义表达阳性。

1.6 预后评估方法

电话随访，随访截止日期为2019年5月1日，中位随访时间为29个月。总生存时间(OS)是指从诊断之日到因任何原因死亡之日或最后随访日之间的时间。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 初诊不同 NLR的MM患者OS分析

生存分析结果显示，高NLR组的中位生存期(13个月)低于低NLR组(36个月)，差异有统计学意义(χ2值分别为21.14，P<0.01)，生存曲线见图1。

2.2 不同NLR组MM患者淋巴细胞亚群表达结果比较

与NLR<2.80组相比，NLR≥2.80组的T细胞绝对值，B细胞绝对值，NK细胞绝对值，CD4+细胞绝对值，CD8+细胞绝对值均显著减少，差异均有统计学意义(P<0.05)；而T细胞、B细胞，NK细胞、CD4+细胞、CD8+细胞和CD4/CD8的百分比差异均无统计学意义。见表1。

图1 初诊时不同NLR的MM患者总生存曲线比较

表1 初诊不同中性粒细胞与淋巴细胞比值(NLR)多发性骨髓瘤患者的淋巴细胞亚群比较

2.3 不同NLR组MM患者免疫分型结果分析

与NLR<2.80组相比，NLR≥2.80组CD117+占51.72%(15/29例)，表达频率增高，差异有统计学意义(P<0.05)；其他抗原分子CD19、CD20、CD56、CD33、CD45、CD71、 Kappa、Lambda的表达无明显变化。见表2。

2.4 相关性分析

分析NLR与各淋巴细胞亚群的相关性，发现NLR值与T细胞绝对值、CD4+细胞绝对值、CD8+细胞绝对值、B淋巴细胞和NK细胞绝对值呈负相关(R=-0.512，P=0.000；R=-0.479，P=0.000；R=-0.441，P=0.000；R=-0.257，P=0.012；R=-0.470，P=0.000)。见图2-6。

表2 不同外周血中性粒细胞与淋巴细胞比值(NLR)多发性骨髓瘤患者的免疫分型结果比较[阳性例数(%)]

图2 NLR与T淋巴细胞绝对值相关性分析

图3 NLR与CD4+T淋巴细胞绝对值相关性分析

图4 NLR与CD8+T淋巴细胞绝对值相关性分析

图5 NLR与B淋巴细胞绝对值相关性分析

图6 NLR与NK淋巴细胞绝对值相关性分析

3 讨论

多发性骨髓瘤是常见于老年人的血液系统恶性肿瘤，病情进展较慢，浆细胞异常增殖和单克隆免疫球蛋白增生导致机体细胞免疫和体液免疫功能异常。因此参与免疫应答的淋巴细胞在多发性骨髓瘤的发病中起到了重要作用[6]。2013年，Kelkitli E等[8]就NLR与MM之间的关系进行了第一次研究报告，结果表明NLR是MM患者OS和无事件生存的潜在预后因素。国内崔壮壮等的研究也表明初诊外周血高NLR是影响MM患者预后的危险因素[9]。我们的研究结果也证明NLR≥2.80组MM患者OS明显短于NLR<2.80组MM患者(36个月vs.13个月；Log-rankP=0.000)。高NLR往往提示预后不良，但目前机制尚不明，猜测可能一方面是因为中性粒细胞通过促进肿瘤血管生成，从而促进了肿瘤的进展[10]；另一方面淋巴细胞具有免疫监视作用，负责肿瘤细胞的清除，在其下降的情况下，促进了肿瘤生长、侵袭[11，12]。本研究结果表明NLR≥2.80组MM患者外周血的T细胞、B细胞、NK细胞、CD4+细胞和CD8+细胞的绝对值较NLR<2.80组的数量明显减少。相关性分析结果显示NLR值与T细胞绝对值、CD4+细胞绝对值、CD8+细胞绝对值、B淋巴细胞和NK细胞绝对值呈负相关。这可能暗示着高NLR多发性骨髓瘤患者体内存在细胞免疫和体液免疫功能的低下和免疫调节功能的异常。

多项研究结果表明，淋巴细胞减少是实体肿瘤和血液恶性肿瘤(包含MM)预后较差的指标[13]。国内外研究者发现MM患者体内免疫系统存在多种缺陷，包括免疫细胞如B细胞，T细胞，NK细胞的数量异常以及功能缺陷。免疫功能障碍是MM的一个重要特征，可导致感染、肿瘤生长增强和对化疗的耐药性。Kay NE曾报道过，在新诊断的MM中，CD4+细胞和CD19+细胞的初始水平较高则预示着更长的存活时间[14]。2001年，一项研究证实了免疫细胞(B、CD4+、CD8+细胞)水平下降与MM患者生存不良有关[6]。国内也有研究证明，在难治组的MM患者中，Th(CD3+ CD4+)细胞，TS(CD3+ CD8+)细胞和NK(CD3-CD16+CD56+)细胞均呈明显下降[15]。Jurisic 等研究证明MM患者NK细胞功能的下降与疾病进展有关，体内NK细胞浓度升高，生存期会延长[16]。NK细胞作为先天免疫系统细胞的一个重要亚群，在防御恶性肿瘤的发生和扩散中起着至关重要的作用。

通过四色流式细胞术(MFC)检测骨髓瘤细胞表面免疫表型特点，已经作为血液系统疾病的常用检测手段，其在辅助诊断、预后评估方面的价值也被越来越多的学者认同。我们应用流式细胞术分析了9个相关抗原标记的表达情况，结果表明CD117+表达频率在NLR≥2.80组MM患者的骨髓瘤细胞中明显升高。CD117是一种酪氨酸激酶，研究显示在正常浆细胞上不表达，但可以在54%的骨髓瘤患者中检测到。也有一些研究表明，CD117+可能代表预后较差的风险类别[17，18]，与本研究结果相一致。

总之，本次研究将初诊MM患者NLR与淋巴细胞亚群联系起来进行分析，结果显示高NLR组的MM患者淋巴细胞亚群绝对计数均减少，CD117+表达频率增高。这些发现表明初诊MM患者外周血NLR的增高、淋巴细胞亚群数量的减少和CD117的异常表达可能是高NLR组不良预后的原因。