宋丽娜，顾芳芳，杨 诚，乔光磊，马俐君

(1.上海交通大学医学院附属同仁医院 肿瘤科，上海200336;2.海军军医大学第三附属医院 特需一科，上海200438)

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是原发性肝癌中最主要的病理分型，约占75%-85%，其恶性程度高，病程进展快，预后差，是恶性肿瘤相关死亡的主要原因之一[1,2]。目前，早期手术切除仍是HCC主要的治疗手段，但HCC起病隐匿，多数患者确诊时已是中晚期，失去了根治性切除病灶的机会，致其五年生存率不足18.1%[3]。因此探索更有价值的生物学标志物对于提高HCC早期诊断水平及改善预后置关重要。

环状RNA(circular RNA,circRNA)是一类不具有5′端帽子和3′端poly A尾的闭合环状结构的RNA分子[4]，其广泛存在于各种生物中，拥有结构保守稳定、组织特异性表达等特征[5]。近期研究表明，circRNA的主要功能包括调控宿主基因表达[6]、miRNA“海绵”作用[7]、提高转录水平[8]及翻译蛋白质[9]等，并且与恶性肿瘤的发生发展、侵袭转移密切相关[10-13]。circRNA具有特殊的环状结构，不易被核酸外切酶降解，稳定性显著优于线性RNA，并广泛存在于肿瘤组织、血液及其他体液中[14,15]，因此其有望成为一种全新的生物学标记物应用于恶性肿瘤的早期诊断及预后评估。前期研究发现，hsa_circ_0008934在有门静脉侵犯的HCC癌组织中高表达，本研究旨在探讨其表达与HCC临床病理特征及预后的相关性，分析其在诊断和预后评估中的临床应用价值。

1 材料与方法

1.1 实验试剂与研究对象

1.1.1主要试剂

Trizol LS试剂(Invitrogen),总RNA提取试剂盒(RNeasy Plus Mini Kit，QIAGEN)，PrimeScript RT Master Mix试剂盒(Takara，大连)，SYBR Premix Ex Taq II试剂盒(Takara，大连)。

1.1.2研究对象

收集2013年8月至2016年7月海军军医大学第三附属医院经手术切除的100例HCC患者的癌组织及配对癌旁组织，20例HCC患者入院手术前的空腹静脉血，所有患者手术前没有接受化疗、放疗、靶向治疗及介入治疗；收集同时期20例健康人的空腹静脉血。本研究经上海市同仁医院和海军军医大学第三附属医院医学伦理委员会批准，随访时间截止至2019年8月。

1.2 实验方法

1.2.1总RNA提取及cDNA合成

取液氮冻存的HCC组织100 mg/例，在液氮中研磨组织成粉末状，加入Trizol LS试剂1 ml提取总RNA；静脉血分离出血浆后，按照试剂盒说明书提取总RNA；用NanoDrop ND-1000(Thero Fisher Scientific,Waltham,MA)检测其浓度及纯度，然后按照PrimeScript RT Master Mix试剂盒说明书制备cDNA，样本置于-20℃保存。

1.2.2转录组测序(RNA-sequening,RNA-seq)

RNA-seq委托上海烈冰信息科技有限公司进行，提取3例有门静脉侵犯的HCC和3例无门静脉侵犯的HCC癌组织中的总RNA，通过RiboMinus试剂盒去除rRNA，Rnase R去除线性RNA；使用NEBNext RNA超快速定向文库制备试剂盒(Illumina，美国)预处理RNA，构建测序文库，Hiseq 2000(Illumina，美国)测序仪进行分析，差异基因的筛选标准：|log2FC|>1，且P值小于0.05。

1.2.3qPCR检测

hsa_circ_0008934上游引物序列：5′-CCATCTCACATGCCACATACA-3′，下游引物序列：5′-ATATTCACACATTTGGAGCTGAA-3′，内参GAPDH上游引物序列：5′-GGGAGCCAAAAGGG-TCAT-3，下游引物序列：5′-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3′，由生工生物工程(上海)合成引物序列；使用LightCycler 480II (Roche)进行qPCR检测，反应体系为20 μl，包括2x SYBR Premix Ex Taq 10 μl，上下游引物各0.5 μl，ROX 0.5 μl，cDNA样本 0.5 μl，RNase-free H2O 8.1 μl；循环参数：预变性95℃ 5 min，95℃ 5 s，59℃ 10 s，72℃ 30 s，共40循环。采用2-△△Ct法计算相对表达量，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的纯度及分子量。

1.2.4Sanger测序

测序PCR体系：总体积20 μl ，PCR产物30 ng，1 μl测序引物，2 μl测序染料，3 μl测序反应液，灭菌超纯水补齐；扩增程序：96℃ 1 min；96℃ 10 s→50℃ 5 s→60℃ 4 min(25个循环)，4℃ 保温。产物经纯化后加入Hi-Di formamida充分振荡溶解，95℃ 5 min→冰中冷却4 min，然后通过ABI 3730测序仪分析。

1.2.5统计学方法

采用SPSS13.0软件进行数据统计分析，计量资料采用均数±标准差描述，两组间比较选择独立样本t检验，采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，应用单因素(log-rank)及多因素COX回归模型分析，得到HCC预后的危险因素；Gradpad Prism5.0软件绘制受试者工作特征曲线(Receiver operator characteristic curve,ROC)，分析hsa_circ_0008934的诊断价值，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 hsa_circ_0008934在HCC中的表达

通过RNA-seq发现，两组相比，在有门静脉侵犯的癌组织中表达上调的circRNA有14个，其中显著上调，并且国内外未见报道的circRNA为hsa_circ_0008934(图1A)；qPCR检测结果显示，癌组织中hsa_circ_0008934的表达水平显著高于癌旁组织，差异有统计学意义(7.83±1.67 vs 1.58±0.32，P<0.01，图1B)；血浆中hsa_circ_0008934的表达水平显著高于健康人(13.72±8.05 vs 0.94±0.69，P<0.01，图1C)。琼脂糖凝胶电泳表明PCR产物纯度高、分子量大小(150 bp)正确(图2A)，Sanger测序验证PCR产物的backsplice位点正确(图2B)。

图1 hsa_circ_0008934在肝癌中的表达

A.RNA-seq发现差异表达circRNA(High：有门静脉侵犯，Low：无门静脉侵犯) B.癌与癌旁组织中hsa_circ_0008934的表达 C.血浆中hsa_circ_0008934的表达

图2 PCR产物验证

2.2 hsa_circ_0008934与HCC临床病理特征相关性

hsa_circ_0008934高表达与肿瘤直径(P=0.01)、AFP(P=0.03)及组织分化程度(P=0.01)显著相关，而与年龄、性别、TNM分期、HBsAg、AST及ALT均无显著相关(表1)。

2.3 hsa_circ_0008934的诊断价值

为了明确hsa_circ_0008934表达在HCC诊断中的价值，我们针对其血浆表达水平进行了ROC曲线分析，结果表明，hsa_circ_0008934表达在HCC中具有较好的敏感度(80%)和特异度(85%)，AUC为0.851，95%CI为0.703-0.944(图3)。

2.4 hsa_circ_0008934的预后价值

根据癌组织中hsa_circ_0008934的相对表达中位值(2-△△Ct=7.52)分为高和低表达组，生存分析显示低表达组患者的总生存时间(overall survival,OS)显著长于高表达组(38.09±2.99 vs 26.58±2.15，P=0.032,图4)。

2.5 预后单因素分析

单因素分析发现，影响HCC预后的危险因素为TNM分期(P=0.036)、AFP(P=0.029)和hsa_circ_0008934表达(P=0.037)(表2)。

2.6 预后多因素分析

将单因素分析有统计学差异的因素纳入多因素分析，发现hsa_circ_0008934(P=0.033)和TNM分期(P=0.018)为影响HCC预后的独立危险因素(表2)。

3 讨论

原发性肝癌是一种全球高发的恶性肿瘤，每年新发病例约84万，死亡约78万，分别居恶性肿瘤的第6位和第4位[1]。HCC为原发性肝癌的主要病理类型，具有侵袭转移能力强和预后差等特点。由于早期诊断率较低、晚期缺乏有效的治疗手段导致该病预后差[16]，因此研究HCC发生发展的分子机制，寻找可靠稳定的诊断和预后评估分子标志物，对改善其预后至关重要。

表1 hsa_circ_0008934与HCC临床病理特征的关系

图3 hsa_circ_0008934的诊断价值

图4 hsa_circ_0008934的预后价值

表2 HCC预后的单因素与多因素分析

CircRNA通过非线性反向剪接方式，将3′末端与5′末端连接在一起形成环状结构，具有稳定性强、高度保守及组织特异性等特点[17]。近期研究发现，circRNA在HCC的发生发展中发挥重要作用[18,19]，某些还可稳定表达于唾液、血液及其他体液中，为其作为生物学标志物奠定基础。hsa_circ_0000567在HCC癌组织中低表达，低表达水平与较大肿瘤直径、较低分化及较差预后密切相关，可作为miR-421的分子海绵，通过靶向MAPK14，抑制肿瘤细胞生长，发挥抑癌因子及预后标志物的作用[20]。hsa_circ_001569在HCC癌组织中高表达，高表达水平与较大肿瘤直径、较晚TNM分期及较差预后密切相关，其通过分子海绵机制结合miR-411-5p和miR-432-5p，促进肿瘤细胞增殖、侵袭转移[21]。在诊断方面，也发现了多个circRNA[22,23]在血液中的表达具有较高的敏感度和特异度，提示circRNA具有早期诊断的临床应用价值。

本研究中，hsa_circ_0008934在有门静脉侵犯的HCC癌组织中高表达，并且癌组织中hsa_circ_0008934表达水平显著高于癌旁组织，其高表达与较大的肿瘤直径、较高的AFP及较低的组织分化程度显著相关，表明hsa_circ_0008934可能在HCC的疾病发展过程中发挥重要作用。

我们通过ROC曲线分析，发现hsa_circ_0008934具有较好的诊断价值，具有成为一种新的HCC生物学标志物的潜能。预后分析发现，hsa_circ_0008934低表达患者的OS显著长于高表达者，单因素及多因素预后分析发现，hsa_circ_0008934表达与TNM分期是影响预后的独立危险因素。因此hsa_circ_0008934可作为HCC诊断和预后评估的生物学标志物。

综上所述，hsa_circ_0008934在HCC癌组织中高表达，其高表达与较大肿瘤直径、较高AFP、较低组织分化程度及较差预后密切相关，hsa_circ_0008934可作为一种新的生物学标志物用于HCC的诊断和预后评估。