肖盼盼，章 骞，翁 凌,，张凌晶,，杨 爽，刘光明,，曹敏杰,,

（1.集美大学食品与生物工程学院，福建 厦门 361021；2.水产品深加工技术国家地方联合工程研究中心，福建 厦门 361021）

酱油是我国传统调味品之一，因其具有独特的滋味，受到广大消费者的喜爱[1]。2017年，我国酱油年产量已超过600万 t，约占世界总产量的60%[2]。根据酱油制备过程中发酵工艺的不同，我国酱油一般可分为高盐稀态发酵酱油（high-salt liquid fermentation soy sauce，HLFSS）和低盐固态发酵酱油（low-salt solid fermentation soy sauce，LSFSS）。据报道[3]，HLFSS较LSFSS具有更佳的风味，近年前者市场份额逐年攀升。HLFSS生产工艺主要包括制备种曲、制备大曲、大豆泡合盐水制成酱膠后发酵、挤压淋油、处理酱油成品等步骤[4]。

尽管我国酱油产量居世界首位，但生产工艺并不先进，特别是蛋白转化率偏低。据报道，日本酱油行业蛋白质利用率高达92%，而我国约为70%，仍有较多蛋白残留在剩余的固态原料残渣（以下简称酱油渣）中[5]。酱油渣的传统利用方式是被制作成动物饲料[6]，但存在产品NaCl质量分数过高等问题。邱宏端等[7]选用红螺菌科细菌发酵酱渣生产酱渣光合细菌蛋白饲料，边名鸿等[8]研究了多菌种协同发酵酱油渣以生产蛋白质饲料，钟世荣等[9]将菜籽饼粕与酱油渣混合发酵生产蛋白饲料。实际上，酱油渣中残留的蛋白质，如能进一步分解，是制备生物活性肽和氨基酸的良好原料。肖诗英等[10]选用木瓜蛋白酶酶解酱油渣蛋白得到小分子肽；沈晗等[11]通过超声辅助酶法将酱油渣中的蛋白转化为多肽。随着对酶法制备方法的不断优化，酱油渣资源的利用率不断提高[12-13]，但未被利用的酱油渣仍占大多数。为提高酱油渣中剩余蛋白的利用率，使更多蛋白被有效分解而转化为游离氨基酸或小肽，筛选高盐条件下具有活性的蛋白酶至关重要。

我国是虾类养殖大国，2017年虾类产量达351.3万 t，其中，凡纳滨对虾产量为167.2万 t，占养殖虾类年产量的47.6%[14]。在对虾加工过程中，为保证可食部的鲜度，避免黑变，加工企业通常将虾进行去头处理。作为加工副产物的虾头约占虾体质量的30%，除少量用于制备饲料、甲壳素外，大部分被作为废弃物丢弃，不仅造成大量蛋白资源的浪费，而且易造成环境污染。研究发现，虾头消化腺中含有丰富的蛋白酶[15]。因此，充分利用虾头消化腺中的蛋白酶，用于蛋白质酶解，将有益于充分利用蛋白资源，减少环境污染。

本研究从凡纳滨对虾虾头消化腺提取蛋白酶，将其应用于酱油渣蛋白的降解，以期提高酱油酿造原料蛋白质的利用率，降低我国酱油行业的生产成本，实现加工副产物资源的高效利用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活凡纳滨对虾购于某农贸市场；发酵12 个月的大豆残渣（以下简称酱油渣）由某酱油生产企业提供；血管紧张素转化酶（angiotensin I-converting enzyme，ACE）酶液由本实验室从猪肺中纯化制备；BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型） 碧云天生物技术有限公司。

酪氨酸、马尿酰-组氨酰-亮氨酸（hippuryl-histidylleucine，HHL） 美国Sigma公司；Boc-Phe-Ser-Arg-MCA等各种7-甲氧基香豆素-4-乙酸（7-methoxycoumarin-4-acetic acid，MCA）荧光多肽合成底物 日本Peptide Research Institute公司；Tris碱、硼酸、乙酸乙酯、盐酸、三氯乙酸、酒石酸钾钠等均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

PT-2100组织捣碎机 瑞士Kinematica公司；Avanti J-26S XP冷冻离心机 美国Beckman公司；Infinite M200 Pro酶标仪 奥地利Tecan公司；FP-8200荧光分光光度计日本Jasco公司；蛋白质电泳装置 美国Bio-Rad公司；AG-223331 Lambda紫外分光光度计 美国Perkin Elmer公司；G:Box凝胶成像仪 英国Synegen公司；1260高效液相色谱仪 美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 对虾粗蛋白酶的制备

参考方忠兴[16]的方法并作改进。从凡纳滨对虾中分离虾头消化腺，其与20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）缓冲液按1∶10（g/mL）混合，组织均浆后10 000×g、4 ℃离心15 min。离心所得上清液经绢布过滤后的产物即为对虾蛋白酶粗酶液，立即使用或于-20 ℃冻藏保存。

1.3.2 对虾粗蛋白酶活力测定

参考翁凌等[15]的方法并略作修改。将50 μL粗酶液加入到900 μL 20 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0），再加入50 μL Boc-Phe-Ser-Arg-MCA荧光底物（10 μmol/L），于37 ℃以应30 min后，立即加入1.5 mL终止液（甲醇-水-异丙醇（35∶30∶35，V/V））终止以应，以应释放的产物7-氨基-4-甲基香豆素（7-amino-4-methylcoumarin，AMC）用荧光分光光度计在激发波长380 nm和发射波长450 nm处进行测定。

对虾组织蛋白酶B和组织蛋白酶L活力测定用20 mmol/L HAc-NaAc缓冲液（pH 5.5）和Z-Arg-Arg-MCA、Z-Phe-Arg-MCA荧光底物；赖氨酸氨肽酶活力测定用20 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）和Lys-MCA荧光底物，其余方法同上。

酶活力单位（U）定义为每分钟分解MCA荧光底物释放出1 nmol AMC所需酶量。相对酶活力定义为不同NaCl质量分数下所测得的酶活力与对照组（不含NaCl）的酶活力（100%）之比。

1.3.3 酱油渣蛋白的提取

参考刘冬等[17]的方法并略加修改。以酱油渣-蒸馏水1∶4（g/mL）的比例混合，组织均浆后调均浆液pH值至9.5，于37 ℃搅拌60 min后，3 000×g、4 ℃离心20 min，所得上清液即为酱油渣蛋白溶液。上清液用透析袋（截留分子质量3 500 Da）透析除盐后4 ℃贮藏备用。蛋白提取率按式（1）计算：

式中：m1为提取液中蛋白质量/g；m0为样品质量/g；c为样品中蛋白质量分数/%。

1.3.4 蛋白含量的测定

利用BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型）测定提取液及酶解液中的蛋白含量。吸取样品溶液200 μL，加入BCA工作液20 μL，在37 ℃恒温箱中静置30 min，于562 nm波长处测定其吸光度。用凯氏定氮法对大豆及酱油渣样品中蛋白质含量进行测定。

1.3.5 对虾粗蛋白酶酶解酱油渣蛋白

在酱油制备过程中，酱醪含盐量约为15%。将提取的脱盐酱油渣蛋白于121 ℃加热30 min，冷却至室温后加入NaCl至质量分数为15%并调pH值至8.0。以酱油渣蛋白-对虾粗蛋白酶质量比200∶1加入混合，置于37 ℃水浴中酶解72 h，酶解结束后于95 ℃加热10 min，用于后续分析。蛋白降解率按式（2）计算：

式中：m1为提取液中蛋白质量/g；m为酶解液中蛋白质量/g。

1.3.6 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析

参考Laemmli[18]的方法，选用Tricine-SDS-PAGE对除盐后的酶解液进行分析。

1.3.7 酶解前后多肽含量的变化

参考Pantako等[19]的方法对样品中的多肽进行提取，用Lowry[20]法测定酶解前后三氯乙酸可溶性多肽含量的变化。以L-酪氨酸（0～100 μg/mL）为标准。

1.3.8 分子质量分布的测定

参考谢雪琼等[21]的方法并略做修改，采用高效凝胶过滤色谱法测定。分子质量校正曲线所用标准品如下：鱼类小清蛋白II，11 950 Da；50肽，5 617.97 Da；杆菌肽，1 422.69 Da；Gly-Gly-Arg-Tyr，451.48 Da；Tyr，181.19 Da。色谱条件：GF-1260高效液相色谱纯化系统，色谱柱为TSK gel G2000 SWXL（300 mm×7.8 mm），流动相为乙腈-水-三氟乙酸（45∶55∶0.1，V/V），检测波长2 2 0 n m，进样体积1 0 μ L（标准品）、5 0 μ L（待测样品），流速1 m L/min，柱温25 ℃。利用GPC Offline软件进行数据分析，以确定样品分子质量的分布比例。

1.3.9 氨基酸组成分析

采用高效液相色谱法。用浓度为0、50、125、250、500 μmol/L的氨基酸标准品制作标准曲线。色谱条件：GF-1260高效液相色谱纯化系统；色谱柱为ADVANCEBIO AAA；流动相A为10 mmol/L Na2HPO4、10 mmol/L Na2B4O7，流动相B为乙腈-甲醇-水（45∶45∶10，V/V）；检测波长为262 nm（脯氨酸）和338 nm（其余氨基酸）；进样体积1.0 μL；流速1.5 mL/min；柱温40 ℃。根据保留时间确定样品中的氨基酸组成，根据峰面积计算样品中每种氨基酸的含量。

1.3.10 ACE抑制活性的测定

参考Cushman等[22]的方法，并略作修改。在Eppendorf管中先后加入20 μL ACE溶液与20 μL待测样品，充分混匀，37 ℃预热5 min后，立即加入50 μL 6.5 mmol/L HHL溶液（溶于0.1 mol/L硼酸盐缓冲液，pH 8.3，含0.3 mol/L NaCl），于37 ℃加热60 min。用50 μL 1 mol/L盐酸终止以应后，加入300 μL乙酸乙酯，室温、1 000×g离心5 min。取上清液200 μL，真空浓缩去除乙酸乙酯，加入600 μL去离子水充分溶解后，2 000×g离心3 min，在波长228 nm测定上清液的吸光度。其中，对照组用超纯水代替样液，空白组先加入盐酸再加入底物，其余条件不变。IC50代表ACE抑制率为50%时对应的样品质量浓度。ACE抑制率按式（3）计算：

式中：A1为对照组吸光度；As为实验组吸光度；A0为空白组吸光度。

1.4 数据处理

采用Excel 2010对数据进行处理。每组设置3 个平行，以组内的平均变异系数为组内误差进行分析。

2 结果与分析

2.1 对虾粗蛋白酶活力及NaCl质量分数对其影响

图1 对虾粗蛋白酶活力Fig. 1 Activities of crude proteases in shrimp heads

图2 NaCl质量分数对酶活力的影响Fig. 2 Effect of salt concentration on protease activities

对虾粗蛋白酶中所含的3 种主要酶及其活力如图1所示。对虾粗蛋白酶主要由高活力的胰蛋白酶、赖氨酸氨肽酶及组织蛋白酶B+L组成，其活力分别为25.47、5.11 kU/mL和1.70 kU/mL。如图2所示，胰蛋白酶、组织蛋白酶B+L、组织蛋白酶K、苯丙氨酸氨肽酶及赖氨酸氨肽酶的活力先降低后趋于稳定。在高NaCl质量分数下，不同蛋白酶均具有一定的酶活力。甲硫氨酸氨肽酶及丙氨酸氨肽酶的相对酶活力随NaCl质量分数的增加呈现先降低后升高的趋势，在NaCl质量分数为5%时其相对酶活力最低，而NaCl质量分数在25%时，分别达到191%和131%。检测不同浓度KCl对丙氨酸氨肽酶及甲硫氨酸氨肽酶的相对酶活力影响，得到了类似结果。推测当一价金属离子达到一定浓度时对丙氨酸氨肽酶及甲硫氨酸氨肽酶具有一定的激活作用。Lei Fenfen等[23]研究发现从海洋Bacillus licheniformisSWJS33中提取的氨肽酶具有很强的耐盐性，在15%的NaCl溶液中具有150%左右的相对酶活力。Gao Xianli等[24]研究发现，天冬酰胺氨肽酶具有较高的耐盐性，在17.5%的NaCl溶液中仍具有90%左右的相对酶活力。由于对虾粗蛋白酶在高NaCl质量分数下仍具有一定的酶活力，可作为在高盐条件下酶解蛋白的工具酶。

2.2 酱油渣蛋白的提取及酶解分析

以发酵12 个月的酱油渣为原料，采用碱溶的方法对酱油渣残余蛋白进行提取，蛋白提取率可达62.89%。利用Tricine-SDS-PAGE对所提蛋白进行分析，结果显示经过12 个月的发酵酶解，酱油渣中残存的主要是分子质量小于35 kDa的蛋白（图3对照组）。

图3 不同NaCl质量分数下对虾粗蛋白酶酶解酱油渣蛋白的Tricine-SDS-PAGE分析Fig. 3 Tricine-SDS-PAGE analysis of soybean dregs hydrolyzed by crude proteases under different salinities

考虑到酱油在实际酿造过程中含有较高质量分数的NaCl，本研究设计对虾粗蛋白酶在不同NaCl质量分数（15%、17.5%、20%、22.5%、25%）下对酱油渣蛋白进行酶解，如图3所示。在不同的NaCl质量分数下，蛋白均可被有效降解，且降解效果没有显著性差异，该结果与NaCl质量分数对酶活力影响一致。由蛋白降解计算可知，在15% NaCl质量分数下，对虾粗蛋白酶对酱油渣蛋白的降解率可达63.25%。高盐稀态酱油在酿造过程中含盐量较高，酱醪NaCl质量分数达15%左右[25]。一般蛋白酶在该NaCl质量分数下会丧失活性，不适合应用于酱油酿造，而对虾粗蛋白酶在NaCl质量分数高达25%时依然具有酶解酱油渣蛋白的能力，说明对虾粗蛋白酶具有应用于酱油生产提高蛋白质利用率的可能性。

2.3 酶解前后多肽含量的变化

图4 酶解前后样品多肽质量浓度Fig. 4 Peptide contents before and after enzymatic hydrolysis

用酶解前后样品多肽含量的变化显示酶解效果，差异越大则酶解效果越好。酶解前后多肽含量变化如图4所示，酶解前样品的多肽质量浓度为96.16 μg/mL，酶解后达到1 049.55 μg/mL，增加了9.91 倍，表明对虾粗蛋白酶能够酶解酱油渣蛋白且具有良好的酶解效果。

2.4 分子质量分布

酶解前后样品的分子质量分布如图5所示，样品分子质量的分布如表1所示。比较图5a与图5b，加入对虾粗蛋白酶后酱油渣蛋白得到有效酶解，特别是对分子质量大于5 kDa蛋白的酶解作用效果显著，占比由43.78%降至16.85%；小分子质量（小于1 kDa）部分占比明显增多，由28.50%升至58.96%。酶解后分子质量小于500 Da的组分占比接近50%，表明大分子质量蛋白被有效降解，且降解产物以小分子肽和氨基酸为主。

图5 酶解前后样品的分子质量分布色谱图Fig. 5 Chromatogram for molecular mass distribution of samples before and after hydrolysis

表1 酶解前后样品的分子质量分布比例Table 1 Molecular mass distribution of samples before and after hydrolysis

2.5 氨基酸组成分析

如表2所示，酶解前后对比，酶解后氨基酸的种类及含量均有较大程度的增加。游离氨基酸总量由3.01 mg/100 mL增至97.16 mg/100 mL。酶解前后样品中的呈鲜味氨基酸总量由0.35 mg/100 mL增至3.33 mg/100 mL，呈甜味、酸味氨基酸总量由0.75 mg/100 mL增至11.50 mg/100 mL，但呈苦味氨基酸总量也由1.91 mg/100 mL增加至60.15 mg/100 mL。推测在对虾粗蛋白酶酶解酱油渣蛋白的过程中耐盐的氨肽酶发挥了重要作用，使小肽被酶解为游离氨基酸，其种类及含量均有较大幅度的提升。而酶解前样品中游离氨基酸的种类及含量较低是由于透析所导致的。

表2 酶解前后样品的氨基酸含量变化Table 2 Changes in amino acid composition before and after hydrolysis

2.6 ACE抑制活性分析

图6 酶解液的ACE抑制活性Fig. 6 ACE inhibitory activity of enzymatic hydrolysate

ACE能水解缓激肽，引起血管收缩，具有使血压升高的作用。酱油渣蛋白酶解液对ACE具有抑制活性（图6），随着质量浓度增加其ACE抑制活性逐渐增强，IC50为90.02 μg/mL。ACE抑制肽在预防和/或治疗高血压中起重要作用。因此，与普通酱油相比，具有ACE抑制活性的酱油将具有更强的竞争力[26]。

3 讨 论

酱油渣是酱油酿造过程中产生的副产物，酱油渣蛋白在高盐条件下难以降解是造成酱油酿造过程中蛋白利用率低的主要原因。本研究从凡纳滨对虾加工副产物虾头消化腺中提取蛋白酶并对酱油渣蛋白进行酶解。对虾消化腺中含有丰富的蛋白酶，是一种优质的蛋白酶资源。Cao Wenhong等[27]报道了利用超声技术从凡纳滨对虾的头部回收蛋白质的方法。本研究发现，对虾粗蛋白酶中主要含有高活力的胰蛋白酶、组织蛋白酶及氨肽酶，Tricine-SDS-PAGE分析结果显示在不同NaCl质量分数条件下对虾粗蛋白酶均能够有效降解酱油渣蛋白。

对酶解前后结果进行对比发现，酶解后酱油渣蛋白质分子质量明显降低，酶解产物中多肽含量显著升高。据Zhuang Mingzhu等[28-29]报道，分子质量小于500 Da的小肽是酱油风味的主要提供者。Lioe等[30]研究表明酱油中咸味和鲜味主要是由分子质量小于500 Da组分提供。本研究以酱油渣蛋白为原料，以对虾粗蛋白酶为酶解工具酶，所得到的酶解液中小于500 Da组分占比较高，预测在酱油生产工艺中加入对虾粗蛋白酶会使酱油具有更好的风味。

与酶解前相比，酶解后产物中呈味氨基酸及总氨基酸的种类及含量均有较大程度的增加。Goh等[31]指出酱油中的游离氨基酸含量对其感官品质的评价至关重要。酱油中呈味氨基酸含量越高则其风味越鲜美，且相比于蛋白，小分子肽及游离氨基酸更易被人体消化吸收，推测在酿造酱油的过程中加入对虾粗蛋白酶会使酱油具有更好的风味、更高的营养价值。

经检测，本研究合作企业的原料大豆中蛋白质量分数为32.24%，而酱油渣中仍残留9.59%的蛋白，蛋白利用率为70.25%。应用对虾粗蛋白酶对酱油渣蛋白进行酶解，可再利用3.81%的大豆蛋白，即蛋白利用率提高至82.07%。

对酶解液的生物活性进行测定后发现酶解液具有ACE抑制活性。Peng Mingye等[32]报道酱油含有黄酮、异黄酮、酚等许多生物活性成分。Li Huipin等[33]指出从酱油中纯化的具有高抗氧化活性的成分可用作食品工业中的生物活性成分。Zhu Xiaolin等[34]曾从酱油中鉴定出具有ACE抑制活性的小肽。

4 结 论

本研究从凡纳滨对虾虾头消化腺中提取对虾粗蛋白酶，并将其应用于酱油豆渣蛋白质的进一步酶解。进行Tricine-SDS-PAGE、多肽含量变化、分子质量分布、游离氨基酸种类及含量变化测定，对酶解效果进行表征，结果均表明对虾粗蛋白酶能够有效酶解含盐酱油渣蛋白。利用对虾粗蛋白酶酶解酱油渣蛋白可使大豆蛋白利用率提高11.82%。酶解产物对ACE表现较高的抑制活性，其IC50为90.02 μg/mL。本研究可为虾头和酱油豆渣的高值化利用、解决我国酱油行业蛋白质利用率低的问题提供理论参考。