钱 柳，米亚妮，陈 雷，滕 慧

（福建农林大学食品科学学院，福建 福州 350002）

花色苷由花青素和各种糖以糖苷键结合而成，主要分为天竺葵色素、矢车菊素、飞燕草色素、芍药色素、牵牛色素和锦葵色素6大类[1-2]，其中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-glucoside，C3G）是自然界中分布最广的天然色素[3]。C3G具有抗氧化、抗糖尿病、抗微生物、抗癌、保护心血管、保护神经、保护视力等多种生理功能，能够调节机体功能，有效预防慢性疾病的发生[4-6]。自然界中存在的C3G易受环境因素和食品加工条件影响，使其水解或开环降解，从而导致C3G的大量损失[7]，所以研究如何通过修饰C3G结构和提高其稳定性具有重要意义。

乳清蛋白（whey protein，WP）是从乳清中得到的球状蛋白质，约占牛乳总蛋白的20%，含有所有的必需氨基酸[8]，具有营养价值高，易消化吸收等特点[9]。WP具有凝胶性、乳化性、起泡性和涂层性[10]，研究表明，通过物理或生化手段使WP多肽链或氨基酸发生变化，可以引起其分子空间结构发生变化，从而改变WP的功能特性[11-12]。Schong等[13]发现将WP进行加热碱化处理，并进行喷雾干燥后，可以形成稳定的WP微球，在不同pH值条件下，粒径会发生可逆变化。Arroyo-Maya等[14]发现将WP进行酸热处理后，加入果胶组装成生物纳米颗粒，能够有效包埋花色苷，提升花色苷的热稳定性，但是对其颜色稳定性方面无明显作用。Hu Yan等[15]研究表明热改性WP可通过疏水相互作用或氢键对柑橘皮中的类黄酮物质进行封装保护，包埋后的类黄酮物质在体外模拟消化中能够实现靶向释放，大大提高其生物利用度。Chen Lei等[16]发现利用微囊化技术，对多酚类化合物进行封装，可以提高酚类化合物的生物利用度。这些发现都表明WP可作为一种极具潜力的多酚类物质的递送载体，不仅提高多酚物质的稳定性，大幅度提高其生物利用率，而且成本低、风险小，能够在食品加工中发挥巨大作用。

本研究利用热改性方法构建WP纳米粒子运输载体，通过纳米粒的粒径电位和载药性能变化确定WP-C3G纳米粒的最佳组成比例，采用透射电镜（transmission electron microscope，TEM）和傅里叶红外光谱（Fourier transform infrared，FTIR）研究纳米粒的结构变化，探讨了WPC3G纳米粒在体外消化中的缓释性和稳定性，并进一步研究WP在贮藏中对C3G的保护作用，为花色苷在应用加工方面提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

C3G（≥98%）、WP（≥80%） 上海源叶生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

Zetasizer Nano ZS纳米粒度分析仪 英国Malvern公司；HT-7700 TEM 日本Hitachi公司；Vertex 70 FTIR仪 德国Bruker公司；1260 Infinity高效液相色谱仪美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制和复合纳米粒的制备

采用Hu Yan[15]和Giroux[17]等方法进行一定改进。准确称取WP和C3G分别溶于水溶液中配制2 mg/mL WP和2 mg/mL C3G溶液，室温以500 r/min连续搅拌2 h，4 ℃静置过夜后，调节WP溶液pH值为7.0，80 ℃水浴加热30 min，5 000 r/min离心30 min后取上清液，将溶液放在4 ℃避光保存。

将C3G溶液与WP溶液分别以体积比为0∶1、1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100混匀，500 r/min搅拌1 h，分别加入不同量的1 mol/L CaCl2溶液使最终Ca2+浓度为8 mmol/L，连续振荡搅拌2 h，超声30 min后，制得样品1～6号纳米溶液，4 ℃避光保存。

1.3.2 高效液相色谱法测定C3G含量

高效液相色谱条件：将样品过0.2 μm有机滤膜，色谱柱为SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相A为0.2%磷酸溶液，流动相B为乙腈。洗脱梯度：0～15 min，8%～20% B；15～17 min，20%～8% B；17～20 min，8% B，流速为1 mL/min。紫外检测器的检测波长：520 nm，进样量：10 μL。

1.3.3 WP浓度的测定

参照BCA蛋白浓度测定试剂盒法进行测定。

1.3.4 纳米粒载药量和包埋率的测定

参考Hu Yan等[15]的方法进行一定改进。将C3G溶于水中配制与5号样品中C3G最终质量浓度相同的7号样品，将样品在12 000 r/min离心20 min，采用高效液相色谱法计算上清液中游离C3G的质量分数。

式中：W0为7号样品中C3G质量分数；W1为2～6号样品上清液中C3G质量分数；W为2～6号样品中WP-C3G纳米粒的总质量分数。

1.3.5 粒径与电位的分析

将1～6号纳米溶液分别用水溶液稀释100 倍，将样品充分振荡摇匀，用纳米粒度仪测量溶液的粒径大小分布与电位值。

1.3.6 TEM分析

采用TEM分析1号与5号样品形态变化，分别取一滴溶液于铜网上，自然晾干后，用2%磷钨酸溶液进行染色，负染30 min后，用滤纸吸走多余染液。将铜网置于TEM下观察并拍照。加速电压为80 kV。

1.3.7 FTIR的分析

将1号和5号样品冷冻干燥成粉末，用KBr压片法进行FTIR分析，测定波数为500～4 000 cm-1，分辨率为4 cm-1，扫描次数设为32 次，数据用Nicolet Omnic v8.0和Origin 9.0软件进行分析。

1.3.8 模拟体外消化分析

参考Chen Lei等[18]的方法进行一定改进。模拟胃消化：将0.125 g胃蛋白酶、0.25 g氯化钠完全溶于250 mL水中，配制胃消化液。分别取12 mL的5号和7号样品，加入8 mL胃液，用6 mol/L HCl溶液调节溶液pH值至2.0。将混合液37 ℃水浴振荡（200 r/min）2 h，分别在以应第0、5、30、60、90、120分钟取样，消化液放于-20 ℃待测。

模拟肠消化：将0.05 g胰蛋白酶、0.625 g猪胆盐完全溶于250 mL水中，配制肠消化液。分别取5号和7号样品的胃消化液，加入8 mL肠液，用1 mol/L NaHCO3溶液调节pH值至7.0。将混合液37 ℃水浴振荡（200 r/min）4 h，分别在以应第0、15、60、120、180、240分钟取样，用1 mol/L HCl溶液调节溶液pH值至2.0，消化液放于-20 ℃待测。

1.3.9 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析

将WP与WP-C3G消化样品进行SDS-PAGE分析，并将消化前后的纳米溶液进行对比分析。

1.3.10 C3G保留率和释放率的测定

消化液在12 000 r/min离心10 min，取上清液。采用高效液相法测溶液中C3G质量分数，不同时间C3G的保留率和释放率计算公式如下：

式中：W0为上清液中C3G的质量分数；W1为C3G消化量；W为加入的C3G总质量分数。

1.3.11 C3G贮藏稳定性分析

将5号和7号样品置于4 ℃避光贮藏20 d，每隔4 d测定溶液中C3G质量分数和颜色变化，采用pH示差法计算溶液中C3G的保留率。

式中：N为0、1、2、3……20。

1.4 数据分析

实验均做3 组平行，结果以 ±s表示。采用SPSS 20软件处理数据，P＜0.05，差异显著；运用Origin 9.0 进行绘图。

2 结果与分析

2.1 纳米粒粒径与电位分析

表1 样品1～6号的粒径大小分布及电位值Table 1 Particle size distribution, PdI and Zeta-potential of samples 1 through 6

当WP经过热处理后，由表1可知WP溶液粒径为（242.42±2.31）nm＜1 μm时，可确认为纳米级溶液，与Hu Yan等[15]中WP纳米粒相比，样品1具有较大的粒径，但是其PdI值为（0.23±0.01），电位为（-24.71±1.95）mV，溶液分布更均一稳定。样品2中溶液粒径为最大值（739.57±34.74）nm，其PdI值高达（0.63±0.14），电位值仅为（-7.24±0.21）mV，溶液分布集中且不稳定，主要是因为C3G可充当多齿状配基，作为桥联剂使WP形成二聚体或多聚体，所以溶液中未被包埋的C3G可促使WP发生聚集以应[19]。在样品2～5中，随着WP体积比增加，WP-C3G纳米粒的粒径和PdI值逐渐降低，电位值则逐渐升高，表明纳米溶液分布逐渐均匀且稳定，当C3G与WP体积比为1∶80时，粒径（275.51±3.15）nm、PdI（0.28±0.01）和电位（-16.92±1.04）mV均达到最小值，粒径越小表示纳米粒间结构联系更紧密[20]，而W P包埋小分子C 3 G后也可导致纳米颗粒表面积增加，所以WP-C3G相比于WP纳米粒子具有较大的表面积。随着WP的比例增加，6号样品粒径（（300.82±9.46）nm）和电位值（（-11.01±0.00）mV）也随之增加，而溶液分布状态不变，可能是因为WP与C3G体积比小于临界值，并发生相互作用导致溶液中WP产生一定程度的聚集。

2.2 纳米粒蛋白质量浓度、包埋率和载药量分析

表2 1～6号样品的蛋白质量浓度、包埋率及载药量Table 2 Protein concentrations, encapsulation and loading efficiencies of samples 1 through 6

如表2所示，样品1号溶液中实际蛋白质量浓度为（0.98±0.07）g/L，蛋白质量浓度主要与C3G和WP的比例有关。在2～5号样品中，纳米粒的包埋率逐渐升高，而载药量逐渐降低，其中5号样品的包埋率最高（97.09±2.39）%，此时纳米粒的载药量为（2.43±0.05）%，而6号样品中的包埋率和载药量为最低值（（69.99±4.37）%、（1.41±0.07）%）。结果表明，5号纳米粒中C3G的包封效果最为显著，WP能够有效构建纳米粒子运输载体，此时C3G和WP最优组合比例为1∶80。纳米粒的载药性能是包埋过程的重要特征参数，而随着纳米粒的包埋率增加，载药量却降低，这一结果与Jelvehgari等[21]报道一致，其中纳米粒的载药量与C3G在纳米溶液中的含量有关，而WP与C3G之间的相互作用也可能影响纳米粒的包埋率和载药量，导致其包埋率和载药量都减少。

2.3 TEM分析

图1 WP和WP-C3G TEM图像Fig. 1 TEM images of WP and WP-C3G

WP经过热处理后（图1A、B），通过二硫键与氢键形成蛋白膜，其溶液中纳米粒子都为规则的空心纳米球状，粒子呈均匀分散状态，其中含有较大粒径的蛋白粒子主要是因为在Ca2+的作用下，WP间产生聚集体。而WP与C3G结合后（图1C、D），粒子表面明显像是覆盖了一层薄涂层，形成了典型的“核-壳”结构，这表明C3G与WP分子间发生强烈的相互作用，并被其完全包埋。而纳米粒径有所降低，可能是因为C3G与WP结合形成的共价复合物粒径小于WP的分子聚集物。样品在TEM中的粒径均小于纳米粒度仪的测量结果，主要是因为TEM是利用普通光学成像原理，从而分析和观察样品的内部结构，而纳米粒度仪是运用动态光散射法分析，根据纳米粒在溶液中做布朗运动的速率测量其粒度和分布情况，其结果具有真实性和有效性[21]，所以纳米粒的粒径以纳米粒度仪测量结果为准。

2.4 FTIR分析

图2 WP和WP-C3G FTIR图Fig. 2 FTIR spectra of WP and WP-C3G

WP的FTIR光谱可显示不同酰胺带，其中蛋白酰胺I谱带为1 600～1 700 cm-1，其由C＝O拉伸引起；酰胺II谱带为1 500～1 600 cm-1，而出现在小于1 548 cm-1的区域为C—N伸展和N—H弯曲导致[22-23]。如图2所示，WP中酰胺I带的峰值从1 645.25 cm-1移到1 643.31 cm-1，酰胺II带的峰值从1 544.95 cm-1移到1 552.67 cm-1。酰胺I和II谱带的变化是由于C3G与WP的C＝O、C—N和N—H基团相结合以及WP结构中氢键的发生变化导致。FTIR光谱变化证实，加入C3G后，WP的二级结构发生变化，酰胺I带的减弱，表明WP的α-螺旋程度降低，这与He Zhiyong等[24]报道的结果一致。

图3则对酰胺I带中不同子峰对应的二级结构变化进行定量分析，其中1 610～1 640 cm-1为β-折叠，1 641～1 650 cm-1为无规卷曲，1 651～1 660 cm-1为α-螺旋，1 661～1 700 cm-1为β-转角[25]。WP结合C3G后，其二级结构变化主要表现为α-螺旋从17%降至15%，β-转角从33%降至32%，β-以向折叠从34%升至36%，无规卷曲从16%升至17%。结果与He Zhiyong等[24]通过圆二色谱对WP与C3G结合前后的二级结构变化分析基本相同，进一步表明，与C3G结合后，WP的二级结构发生明显变化，其中WP的氢键发生断裂，二级结构的氢键化程度发生改变，导致螺旋结构被破坏，蛋白伸展。而β-以向折叠和无规卷曲增多，则表明WP的结构松散，其空间构象稳定性降低。

图3 WP（A）和WP-C3G（B）蛋白二级结构分析Fig. 3 Secondary structure analysis of WP (A) and WP-C3G (B)

2.5 模拟体外消化分析

2.5.1 SDS-PAGE分析

WP中的主要蛋白质为β-乳球蛋白和α-乳白蛋白，含量分别为55%和24%，都含有大量的氨基酸[26]，而Ca2+则与这些氨基酸的游离羧基结合，形成交联盐桥。如图4A所示，对照蛋白Marker，β-乳球蛋白的分子质量约为18 kDa，α-乳白蛋白分子质量约为14 kDa，这与Ballerini等[27]的研究基本相同，与C3G结合后，WP的分子质量和多肽链无明显变化。如图4B所示，加入胃蛋白酶后，α-乳白蛋白迅速分解，生成小分子质量多肽，随着消化时间的延长，其他蛋白质也逐渐分解，而β-乳球蛋白无明显酶解以应，这是因为β-乳球蛋白是WP中疏水性最强的部分，其中疏水性氨基酸在多肽链中易造成空间位阻，降低酶解以应速率[28]。而β-乳球蛋白对胰蛋白酶的极其敏感，由图4C所示，胃消化液加入胰蛋白酶后，β-乳球蛋白迅速酶解，也表明WP在人体内能较易被消化吸收。但经过胃肠模拟消化后，WP的分解过程与C3G结合前后并无明显变化。

图4 WP和WP-C3G的SDS-PAGE图谱Fig. 4 SDS-PAGE patterns of WP and WP-C3G

2.5.2 C3G保留率分析

图5 WP-C3G和C3G模拟体外消化中C3G的保留率Fig. 5 Retention rates of C3G and WP-C3G during in vitro digestion

由图5A所知，在模拟胃消化环境中，C3G酶解速率极低，消化2 h后保留率依然有（96.4±0.2）%，而WPC3G在消化开始5 min后就出现缓慢酶解趋势，消化2 h后保留率为（86.25±0.81）%。如图5B所示，加入胰蛋白酶后，C3G出现大量降解，仅有（28.21±0.33）%残留，其降解率高达（62.09±0.53）%，在4 h酶解后，最终剩余（9.14±1.32）%。而WP-C3G则保持一定的下降趋势进行酶解，加入胰蛋白酶后，有（75.59±0.77）% C3G残留，降解率仅为（10.80±0.01）%，与未结合WP的C3G相比，降解率降低（51.34±0.52）%，其降解程度有明显改善，消化4 h后，最终消化液中还剩（31.43±2.40）% C3G。研究表明，C3G在酸性模拟胃消化环境中，中性条件下的花色苷醌式碱转化为黄烊盐阳离子，几乎不发生降解，而在进入中性模拟肠消化环境中，C3G的不稳定性导致迅速分解[29]，其降解速率大于消化速率，使其生物利用度极低。C3G在结合WP后，由于α-乳白蛋白对于胃蛋白酶的敏感性，在模拟胃消化环境中，包裹了C3G的α-乳白蛋白迅速酶解，部分C3G也随之消化分解，而进入到肠模拟消化环境中，由于WP在碱性条件下并不会迅速分解，其中的C3G保持一定的速率逐渐被消化分解，进一步证明WP纳米粒子可将C3G进行定向运输，提高了C3G的生物利用度。

2.5.3 C3G释放率分析

图6 WP-C3G模拟体外消化中C3G释放率Fig. 6 Release rate of C3G from WP-C3G during in vitro digestion

如图6所示，在加入胃蛋白酶30 min后，C3G释放率达到（10.57±1.72）%，消化2 h后，释放率为（18.02±1.01）%。在肠模拟环境中，C3G释放率显著提高，在消化1～2 h时，释放速率最快，而2～3 h时，释放速率最低，消化4 h后，C3G释放率达到（87.25±3.72）%。结果显示，α-乳白蛋白会在加入胃蛋白酶30 min后大量酶解，随后C3G缓慢释放，而在模拟肠液中，由于胰蛋白酶的酶解作用，C3G被大量释放，消化4 h后，释放率提高69%，显然模拟肠消化环境是C3G被释放的主要场所，而且WP-C3G纳米粒在体外模拟消化后的C3G释放率远高于Flores等[30]的研究结果，这说明WP纳米粒子对于C3G有很好的缓释性。WP-C3G中的C3G浓度在模拟肠液中是呈现动态变化趋势，一方面WP酶解释放C3G，另一方面C3G在中性环境下不断降解，当C3G释放率大于降解率时，消化液中C3G浓度升高；C3G释放率小于降解率时，消化液中C3G浓度降低，所以模拟肠胃消化后的WP-C3G中的C3G浓度高于未结合WP的C3G中的含量，而实验结果也证明WP对于C3G能起到很好的缓释包埋作用。

2.6 C3G贮藏稳定性分析

图7 WP和 WP-C3G贮藏20 d内C3G含量变化Fig. 7 Degradation rates of free C3G and WP-C3G during 20 days of storage

如图7所示，在贮藏0～8 d时，C3G的降解速率最大，其中第8天时，WP-C3G的降解率为28%，C3G的降解率为38%，之后C3G的降解速率明显降低，WP-C3G的降解速率约为0.7%，而未结合WP的C3G的降解速率为1.3%。在第8～12天内，C3G溶液以1%的速率降解，C3G溶液在贮藏20 d后，最终C3G保留率为（42.62±2.33）%，而WP-C3G中的保留率为（64.14±1.70）%，比未结合WP的C3G中的C3G保留率提高了1.9 倍。加入Ca2+可以在蛋白质分子间发生离子结合以应，由于Ca2+具有较高的离子强度，也可有效的降低蛋白质单体之间的静电排斥，从而促进蛋白质与单体之间的聚合，使C3G与WP通过疏水相互作用结合形成低孔隙的致密结构，减慢氧气向颗粒中的扩散，并减缓C3G在中性条件下的降解速率[31]。结果表明WP可以对C3G起到显著保护作用，能够有效降低C3G发生降解以应。

3 结 论

经过热处理变性的WP，在中性条件下加入金属离子Ca2+形成纳米粒子，纳米粒子能与C3G结合形成生物聚合性复合物，并显著提高C3G的稳定性。通过纳米粒度仪研究WP的纳米直径分布、电位值和载药性能变化，确定C3G与WP的最优结合体积比为1∶80。TEM和FTIR研究结果表明WP与C3G结合后，其纳米颗粒大小和蛋白二级结构都会发生改变。体外模拟消化研究表明，C3G与WP结合后，C3G在肠消化环境中，其降解速率明显降低，由于WP易被人体消化吸收，不仅能够实现C3G胃肠道靶向释放，还可以提高C3G在人体内的消化利用率。在贮藏性能方面，WP-C3G在贮藏时的损失率较低，C3G的降解速率缩短，货架期延长。研究表明，WP可以降低C3G在食品加工、运输和消化吸收中降解和损失，是一种极具潜力的新型纳米材料。