曹春红 李 爽 王海燕 张广民 蔡辉益

（1.天津挑战博德生物技术有限公司，天津301906；2.生物饲料开发国家工程研究中心，北京100081）

蛋白酶是水解蛋白质肽链的一类酶的总称，可分为酸性蛋白酶（pH 值2.5～3）、中性蛋白酶（pH 值6.5～7.5）和碱性蛋白酶（pH值10.5）3种[1-2]。中性蛋白酶是最早被发现，并且在饲料工业、酿酒酿造、制药工业、化妆品、洗涤剂、毛皮软化等领域中被广泛使用[3-10]。国内外学者对蛋白酶的研究结果表明，发酵工艺不同，同一菌株的酶活力有较大的差异，酶活力的高低直接影响蛋白酶的经济效益。因此，提高蛋白酶发酵水平是很有必要的。最近几年，国内外关于提高蛋白酶发酵酶活力的研究有了较大进展，如曾诚等[11]报道的解淀粉芽孢杆菌所产中性蛋白酶活力为6 984.3 U/ml。

本研究所采用的产中性蛋白酶菌株为解淀粉芽孢杆菌，该解淀粉芽孢杆菌具有较高的产中性蛋白酶能力。通过单因素实验和正交实验对该菌株的发酵培养基组成进行了优化，选择出廉价且适合工业化使用的培养基原料，同时优化培养条件，提高酶活力，达到降低发酵成本、提高中性蛋白酶的发酵酶活力的目的，为其工业化生产奠定扎实基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

解淀粉芽孢杆菌YF03，由天津挑战博德生物技术有限公司实验室保存。

1.2 培养基

1.2.1 斜面培养基

蛋白胨1%、酵母粉0.5%、氯化钠1%、琼脂2%，pH值7.0～7.2。

1.2.2 种子培养基

蛋白胨1%、酵母粉0.5%、氯化钠1%，pH值7.0～7.2。

1.2.3 发酵培养基

葡萄糖3%、豆粕2%、麸皮2%、KH2PO40.4%、Na2HPO40.05%。

1.3 培养方法

将解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）YF03 在斜面上37 ℃培养24 h 后，接至种子培养基中，并于摇床37 ℃、200 r/min 培养8 h，以5%的接种量转至发酵培养基(100 ml/500 ml三角瓶)中，30 ℃培养48 h。

1.4 分析方法

1.4.1 中性蛋白酶活力的测定

按照GB/T 28715—2012《饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力的测定分光光度法》进行酶活力的测定。

1.4.2 菌体生物量的测定

取一定体积的菌液在600 nm 测定其吸光值，即菌体的生物量。

1.5 主要试剂

碳酸钠溶液、三氯乙酸溶液、福林(Folin)试剂、磷酸缓冲液（pH值7.2）、1%中性酪蛋白溶液(pH值7.2)。

2 结果

2.1 发酵培养基的优化

2.1.1 不同碳源对菌株产酶活力的影响

将发酵培养基中3%葡萄糖分别替换成玉米粉、可溶性淀粉、甘油、蔗糖，其发酵产酶活力结果如图1所示。

由图1 可以看出，菌株YF03 对玉米粉和葡萄糖的利用效果均较好。初始发酵培养基中以葡萄糖为碳源，发酵结束时酶活力为4 230 U/ml，通过比较可以看出玉米粉为碳源的酶活力更高，为5 205 U/ml。而且玉米粉价格低廉，因此选择玉米粉作为YF03 发酵培养基的最佳碳源。当以蔗糖、可溶性淀粉等为碳源时菌株产酶能力较低。这是因为易于被微生物利用的碳源或氮源有助于细胞生长，难以被微生物直接利用的碳源或氮源则有助于产酶[12]。

图1 不同碳源对菌株产蛋白酶活力的影响

2.1.2 不同碳源含量对菌株产酶活力的影响

将玉米粉作为碳源，添加量分别为1%、2%、3%、4%、5%，经摇瓶培养后，测定发酵液中中性蛋白酶活力，结果如图2所示。

图2 玉米粉含量对菌株产蛋白酶活力的影响

从图2 可知，当玉米粉含量低于5%时，随着玉米粉含量的升高，中性蛋白酶的酶活力越高。玉米粉含量为5%时，发酵产生的中性蛋白酶活力最高，为6 360 U/ml。因此，初步确定菌株发酵培养基的玉米粉含量为5%。

2.1.3 不同氮源对菌株产酶活力的影响

将发酵培养基中2%豆粕分别替换成豆饼粉、鱼粉、玉米蛋白粉、棉粕、氯化铵，经摇瓶培养后，检测发酵液中性蛋白酶活力，结果如图3所示。

通过比较几种常见氮源对YF03产中性蛋白酶的影响，可以看出，菌株对棉粕的利用效果最好，发酵酶活力为7 230 U/ml，其次是豆饼粉、豆粕，对氯化铵、玉米蛋白粉、鱼粉的利用效果不是很明显。棉粕和豆饼粉相比，价格上低于豆饼粉，且大豆多依赖于进口、易受国际经贸的影响，而棉粕在供应和价格上比较稳定。因此选用棉粕作为YF03发酵培养基的最佳氮源。

图3 不同氮源对菌株产蛋白酶活力的影响

2.1.4 不同氮源含量对菌株产酶活力的影响

将棉粕作为氮源，添加量分别为1%、2%、3%、4%、5%，经摇瓶培养后，测定发酵液中中性蛋白酶活力，结果如图4所示。

图4 棉粕含量对菌株产蛋白酶活力的影响

由图4可知，当棉粕含量低于3%时，随着棉粕含量的升高，发酵液中性蛋白酶活力越高；当棉粕含量高于3%时，棉粕含量越高，酶活力越低，可能是棉粕含量过高，导致培养基中碳源、氮源比例不合适。因此可以初步确定发酵培养基的最适氮源含量为3%，此时酶活力为7 899 U/ml。

2.1.5 不同麸皮含量对产酶活力的影响

在发酵培养基中，分别添加1%、2%、3%、4%、5%的麸皮，经摇瓶培养后，测定发酵液中中性蛋白酶活力，结果如图5所示。

由图5可知，当麸皮含量为2%时，菌株对其利用效果最好，产生的中性蛋白酶活力最高，为7 921 U/ml。因此可以确定菌株发酵培养基中麸皮的含量为2%。

图5 麸皮含量对菌株产蛋白酶活力的影响

2.1.6 不同金属离子对产酶活力的影响

分别向发酵培养基中添加0.1% CaCl2、0.5% Ca-Cl2、0.1% MgSO4、0.5% MgSO4、0.1% ZnSO4、0.5% Zn-SO4、0.1% FeSO4、0.5% FeSO4、0.01% MnCl2、0.1% Mn-Cl2，经摇瓶培养后，测定发酵液中中性蛋白酶活力，结果如图6所示。

由图6 可以看出，与对照组相比，培养基中添加0.1% MgSO4时发酵生成的中性蛋白酶活力提高11%，为8 746 U/ml。当MgSO4含量提高为0.5%时，反而不利于酶的生成。芽孢杆菌的代谢网络中主要包括EMP 途径、HMP 途径和TCA 循环，Mg2+是其代谢酶的辅助因子，而且Mg2+参与微生物细胞壁的形成，Mg2+是细胞生长所必需的金属离子[13-14]，所以硫酸镁对菌株产酶活力的促进作用最明显。

图6 不同金属离子对菌株产蛋白酶活力的影响

培养基中添加0.01% MnCl2，发酵生成的中性蛋白酶活力提高5%。Mn2+是该中性蛋白酶中的活性中心，MnCl2对菌株产中性蛋白酶活力有激活的作用。

2.2 发酵培养基配方的正交实验优化

以玉米粉、棉粕、麸皮和硫酸镁含量为影响因子，设计L9(34)正交实验，以确定菌株发酵培养基的最佳配比，其他条件选取以上单因素实验的最优结果。正交实验因素与水平见表1，正交结果见表2。

表1 正交实验因素水平

由表2 可知，各因素影响作用按大小排列为：A＞B＞C＞D。对正交实验结果方差分析可知，FA＞FB＞FC＞FD，即培养基中玉米粉含量对解淀粉芽孢杆菌产酶活力的影响最大，硫酸镁含量对解淀粉芽孢杆菌产酶活力影响最小，但在α = 0.05 水平上都不显著，这可能是由于各因素水平间距较小造成的。理论优化组合为A2B2C3D1，即玉米粉5%、棉粕3%、麸皮3%、MgSO40.1%。在该条件下，解淀粉芽孢杆菌的产中性蛋白酶活力为9 200 U/ml。

2.3 菌株发酵产酶活力培养条件的优化

表2 正交实验结果

2.3.1 菌株生长曲线的绘制

将菌株接种于50 ml LB培养液中，在摇床37 ℃、200 r/min条件下培养。每隔1 h取样，并在600 nm下测定其吸光度值，用未接种的培养液做空白对照。以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制菌体生长曲线(见图7)。

图7 菌体的生长曲线

由图7 可以看出，菌株YF03 的对数生长期为4～8 h，因此在研究发酵条件对菌株产酶活力的影响时，选择8 h的菌液进行发酵培养。

2.3.2 培养基发酵起始pH值的影响

pH 值主要是通过影响微生物细胞的带电状态、氧化还原电位等，进而影响到微生物对营养物质的吸收及酶的分泌。培养基的初始pH值对微生物产生特定的代谢物也有很大影响。实验中设定初始pH值为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，经摇瓶培养后，测定发酵液中性蛋白酶活力，结果如图8所示。

图8 培养基发酵初始pH值对菌株产中性蛋白酶活力的影响

从图8 可以看出，在设定范围内，随pH 值的升高，酶活力先升高后降低，在pH 值为7.0 时培养基中蛋白酶分泌能力最强，酶活力为9 500 U/ml。所以，培养基起始pH值设定为7.0。

2.3.3 培养温度的影响

摇瓶的发酵温度直接影响菌体的生长，同时影响菌体产酶速度。实验中设置温度分别为25、30、37、40、45 ℃，经摇瓶培养后，测定发酵液中性蛋白酶活力，结果如图9所示。

从图9 可以看出，在设定温度范围内，30 ℃是该菌株最适发酵温度。发酵温度过低，不利于菌株生长，发酵酶活力也低；发酵温度过高，菌株衰老加快、蛋白酶稳定性变差、蛋白酶自溶增加，酶活力迅速降低。因此选择30 ℃作为培养温度，此条件下酶活力为15 403 U/ml。

图9 培养温度对菌株产中性蛋白酶活力的影响

2.3.4 接种量的影响

接种量的大小影响着菌株的繁殖速度。一般情况下，接种量越大，延滞期越短。然而接种量过大会使培养基中的营养物质过快地被消耗，代谢废物增多，对菌株产酶产生抑制作用[10]。实验中设置接种量分别为2%、3%、4%、5%、6%，经摇瓶培养后，测定发酵液中性蛋白酶活力，结果如图10所示。

图10 接种量对菌株产中性蛋白酶活力的影响

如图10所示，随着接种量的增加，中性蛋白酶活力也增加。当接种量为5%时，中性蛋白酶活力达到最高值16 700 U/ml。接种量继续增加，中性蛋白酶活力反而下降。实验结果说明接种量过大、过小都会影响到酶的产量，过小会引起菌株长势较慢、产酶能力低，而过大又会造成溶氧不足，根据实验结果最终选择5%的接种量。

2.3.5 培养时间的影响

随着发酵时间的延长，培养基中营养成分会随着菌体的繁殖、生长、消耗发生变化，实验中设置培养时间分别为12、24、36、48、60、72 h，经摇瓶培养后，测定发酵液中性蛋白酶活力，结果如图11所示。

图11 培养时间对菌株产中性蛋白酶活力的影响

如图11所示，在培养初期，中性蛋白酶活力随着发酵时间的延长而不断增加，在菌株发酵培养48 h时，中性蛋白酶活力达到最高值16 523 U/ml，然后又有所降低。酶活力的降低可能是由于解淀粉芽孢杆菌代谢的一些杂酶对蛋白酶产生一定的降解造成的。而且随着发酵时间的延长，培养基中营养物质被不断消耗，在营养物质匮乏的条件下菌株可能以自身产生的蛋白酶为底物进行降解。因此选择48 h 作为发酵培养的最佳产酶时间。

2.3.6 摇瓶装液量的影响

在摇床转速相同的条件下，装液体积直接影响着菌株的氧气供给。在发酵过程中，提供充足氧分条件对于产酶活力的提高起着重要的作用。因此，分别在500 ml三角瓶中装入50、100、150、200、250 ml的发酵培养基，经培养后测定发酵液的酶活力，结果如图12所示。

如图12 所示，当摇瓶的装液量为100 ml/500 ml时，此时中性蛋白酶活力达最高值16 826 U/ml，装液量过大，菌株通气状况变差，所以，选择100 ml/500 ml这一装液量作为菌株发酵产蛋白酶的最佳摇瓶装液量。

图12 摇瓶装液量对菌株产中性蛋白酶活力的影响

3 讨论

蛋白酶是三大酶制剂之首，其销量占全世界酶制剂销量的60%。最近几年，国内外学者在产蛋白酶菌株选育、提高发酵水平等方面已取得较大的研究进展，但蛋白酶的工业化生产，仍然存在产量低、成本高的问题，这在很大程度上制约着蛋白酶的大规模生产与应用。因此，选育高产蛋白酶菌株并优化培养基组成及发酵条件显得尤为重要。

本研究选取的出发菌株是经过选育获得的较高发酵水平的解淀粉芽孢杆菌，通过优化碳源、氮源的种类和浓度，选择玉米粉和棉粕分别作为碳源、氮源。目前菌株发酵产蛋白酶的主要碳源、氮源是葡萄糖、豆粕[11，13，15]，试验中选择玉米粉代替葡萄糖、棉粕替代豆粕，不仅酶活力有显著提高，而且玉米粉、棉粕来源广泛、价格低廉。

枯草芽孢杆菌产生的中性蛋白酶多数是金属蛋白酶，其酶活性主要依赖于某种二价金属阳离子（如Zn2+、Mg2+、Ca2+等），这些金属离子对酶起激活或保护作用，而某些非依赖性阳离子会抑制酶活性[16]。解淀粉芽孢杆菌是一种与枯草芽孢杆菌亲缘性很高的细菌，因此试验研究Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Mn2+等离子对菌株产酶活力的影响。结果表明，Mg2+、Mn2+对菌株产酶起到了激活作用。

本研究在优化后培养基前提下，分别从发酵初始pH值、培养温度、接种量、培养时间、摇瓶装液量几方面优化发酵条件，得出最适的产酶条件，发酵条件优化后的酶活力16 826 U/ml 是优化前酶活力9 200 U/ml的1.83倍。经过培养基和培养条件的优化，最终发酵酶活力是初始发酵酶活力4 230 U/ml的3.98倍。

4 结论

通过单因素实验和正交实验，确定解淀粉芽孢杆菌YF03菌株最适培养基配方为玉米粉5%、棉粕3%、麸皮3%、KH2PO40.4%、Na2HPO40.05%、MgSO40.1%、MnCl20.01%。通过单因素实验，确定了YF03菌株最适摇瓶培养条件为初始pH 值7.0、种龄8 h、接种量5%、装液量100 ml/500 ml、30 ℃、240 r/min培养48 h，此时发酵液中性蛋白酶活力最高，为16 826 U/ml，是初始发酵酶活4 230 U/ml的3.98倍。