张前程，文红梅，刘娜，袁琪，刘睿，崔小兵，李松，陈盛君

(1.南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023；2.江阴天江药业有限公司，江苏 江阴 214434)

地龙为常用动物类中药，2015年版《中国药典》收载地龙为钜蚓科动物参环毛蚓Pheretimaaspergillum(E. Perrier)、通俗环毛蚓Pheretimavulgaris(Chen)、威廉环毛蚓Pheretimaguillelmi(Michaelsen)或栉盲环毛蚓Pheretimapectinifera(Mkhaeken)的干燥体。前一种习称“广地龙”，后三种习称“沪地龙”[1]。地龙具有清热定惊，通络，平喘利尿的功效[2-4]。现代研究表明，地龙还有降压[5]、抗癌[6-9]、抗凝血[10]、抗氧化[11-13]、抗肝纤维化[14]等作用。市场上流通的地龙药材主要为广地龙，广地龙体长、药材加工精细，药理活性显著，临床应用广泛[15]。以其为原料药的中成药有40多个品种，还有广地龙配方颗粒及广地龙汤剂等[16]。广地龙药材与相近物种因形态相似，容易造成品种混杂和掺假现象。广地龙药材的真伪关系着临床用药的有效性和安全性。因此，有必要建立快速准确的特异性物种鉴别方法，以控制广地龙药材的质量。DNA条形码分子鉴定法是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术，是传统形态鉴别方法的有效补充[17-18]。在动物药的鉴别中大多采用通用引物COⅠ序列进行PCR扩增测序，如庞中化等[19]通过COⅠ序列对全蝎及其混伪品进行DNA条形码鉴别；贾静等[20]采用COⅠ序列和ITS序列分别鉴别家蚕和白僵菌。但COⅠ序列不能直接作为特异性引物来区分药材品种，必须对所有的样品进行测序再进行聚类分析构建进化树，成本较高，时间较长。通过设计特异性引物，可省去对扩增产物进行测序、构建进化树等复杂的步骤，操作简便快捷，已用于多种动物药品种的基原鉴定。赵玉洋等[21]通过比较麝香及其混伪品的COⅠ序列，设计出一对约180 bp的麝香微型DNA条形码鉴别引物，对麝香及其混伪品进行测序鉴定；刘富艳等[22]通过比较海龙及其混伪品的COⅠ基因序列差异，根据变异位点设计出刁海龙、尖海龙及拟海龙的特异性鉴别引物，鉴别海龙及其混伪品；陈维明等[23]用12SrRNA序列鉴定了广地龙及其近缘品种；田娜等[24]建立了多重位点特异性PCR鉴别方法区分不同地龙品种。本文前期实验中考察了COⅠ、12SrRNA和16SrRNA 3对引物，结果发现COⅠ序列扩增出的条带更为清晰，利用COⅠ序列对广地龙、沪地龙及其易混品(如海南大腔蚓)等进行PCR扩增和双向测序，通过比对广地龙及其混伪品的DNA测序结果，寻找广地龙的变异位点，设计出广地龙的特异性引物，用于广地龙及其混伪品的鉴定，为广地龙药材的质量评价提供方法。

1 材料

1.1 仪器

PCR扩增仪(伯乐公司，型号：AL110394)；电泳仪(伯乐公司，型号：041BR170879)；浸没式琼脂糖水平电泳槽[生工生物(上海)股份有限公司，RDY-SP6]；化学发光凝胶成像仪(伯乐公司，型号：721BR10360)。

1.2 试药

琼脂糖(批号：4241055)；水为屈臣氏超纯水；Ⅰ型核酸染料(批号：20181012)；DNA Marker(100～2 000 bp)(批号：E905KA9473)；2×Taq PCR Master Mix(批号：20190926)；动物DNA基因组提取试剂盒(TSP 201-200，020190120)。通用引物COⅠ以及设计的特异性引物PA-f/PA-r，由南京擎科医药科技有限公司合成。

1.3 地龙样品的采集和品种鉴定

地龙样品及其伪品共计37批次，其中广地龙(参环毛蚓)14批，沪地龙(通俗环毛蚓)6批，沪地龙(威廉环毛蚓)4批，沪地龙(栉盲环毛蚓)3批，海南地龙(大腔蚯蚓)6批。其他的动物品种水蛭，蜈蚣，僵蚕和蝉蜕各1批。

广地龙购于广东、广西，呈长条状薄片，弯曲，边缘略卷，长15～25 cm，宽1～2 cm。全体具环节，背部棕褐色至紫灰色，腹部浅黄棕色；第14～16环节为生殖带，宽0.8～1.5 cm。

沪地龙药典上收载有3种品种，长8～15 cm；宽0.5～1.5 cm。全体具环节，背部棕褐色至黄褐色，腹部浅黄棕色；第14～16环节为生殖带，较光亮。第18环节有一对雄生殖孔。通俗环毛蚓较常见，购于上海、安徽、河南等地，原动物灰青色，背中线深青色，性状鉴定显示其雄交配腔能全部翻出，呈花菜状或阴茎状。威廉环毛蚓购于宿迁泰通地龙养殖基地，原动物性状鉴定显示其雄交配腔孔呈纵向裂缝状。栉盲环毛蚓采集于上海闵行校区，原动物性状鉴定显示其雄生殖孔内侧有1或多个小乳突。

大腔蚓购于海南，呈长条状薄片，弯曲，边缘略卷，长15～35 cm，宽1.0～2.5 cm。全体具环节，背部棕黑色，腹部浅黄棕色；第14～16环节为生殖带，宽1.6～2.2 cm，呈棕黑色。

所有样品由南京中医药大学中药鉴定教研室陈建伟教授鉴定，保存于南京中医药大学药学院药物分析实验室。样品信息详见表1。

表1 地龙及其混伪品的样品信息表

2 方法

2.1 DNA提取

取已用乙醇擦拭的地龙药材，打粉过五号筛，称取药材粉末约40 mg，使用动物DNA基因组提取试剂盒(TSP 201-200，020190120)提取地龙的总DNA。将提取的DNA模板-20 ℃保存。

2.2 通用引物COⅠ序列的PCR扩增及测序

对收集的不同动物药地龙、蜈蚣、水蛭、僵蚕及蝉蜕进行COⅠ序列的PCR扩增。COⅠ序列正向引物LCO1490：5'-GGTCAACAAATCAAGATATTGG-3'，反向引物HCO2198：5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'。PCR反应体积25 μL，体系包含2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，正向引物LCO1490(10 μmol/L) 1 μL，反向引物HCO2198(10 μmol/L)1 μL，超纯水H2O 8.5 μL，模板(基因组DNA 50 ng)2 μL。扩增程序：94 ℃变性1 min，55 ℃退火1.5 min，72 ℃延伸1 min(进行35个循环)；72 ℃延伸5 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳仪参数设置：电压140 V，电泳时间90 min。

对各批次广地龙以及其他品种地龙进行测序，委托南京擎科医药科技有限公司完成。

2.3 广地龙特异性引物的设计和PCR扩增条件的优化

根据上述测序结果分析广地龙及其混伪品COⅠ序列的扩增产物，同时使用引物设计软件(Snapgene软件)进行序列比对，寻找正品广地龙及其混伪品的COⅠ基因序列扩增产物的差异，在变异位点较多的基因片段处，设计广地龙的特异性鉴别引物。引物组由南京擎科医药科技有限公司合成。

对影响PCR鉴别特异性的主要因素如退火温度(50、55、60 ℃)，循环次数(32、35、38)，DNA模板量(3、5、10、30、50、100 ng)以及Taq DNA聚合酶用量(0.625、1.25、2.50 U)进行考察。确定PCR扩增条件后，利用设计的广地龙鉴别引物对收集的药材进行PCR扩增，鉴别广地龙及其混伪品，验证该引物对的特异性。

3 结果

3.1 通用引物COⅠ序列扩增结果

使用动物DNA基因组提取试剂盒提取广地龙及其混伪品沪地龙、海南地龙以及其他物种蝉蜕、蜈蚣等药材的DNA，经琼脂糖凝胶电泳得到PCR扩增电泳图，见图1，扩增效果较好，条带较亮，没有拖尾现象，COⅠ序列扩增产物均在750 bp左右。通用引物不仅不能区分不同品种的地龙，且无法鉴别地龙和其他动物如蜈蚣，蝉蜕等。

3.2 广地龙特异性引物的确定

经测序采用引物设计Snapgene软件，发现正品广地龙及其混伪品的COⅠ基因序列扩增产物的差异，差异最显著的基因片段见图2。设计得到的广地龙特异性引物为PA-f/PA-r，见表2。

表2 广地龙鉴别引物

3.3 PCR扩增条件的确定

使用设计的特异性引物PA-f/PA-r进行PCR扩增，退火温度在50～60 ℃的范围内，广地龙样品均可以获得574 bp左右的条带，沪地龙通俗环毛蚓、威廉环毛蚓、栉盲环毛蚓及大腔蚓均呈阴性，为确保退火温度的稳定，选择55 ℃为适宜的退火温度，见图3A。在此基础上，考察循环次数对PCR鉴别的影响，设置循环次数为32、35、38，结果显示广地龙均可以获得约574 bp的条带，其中循环35次条带更清晰，沪地龙3个品种及大腔蚓均未获得条带，见图3B，故选择循环次数为35次。进一步对PCR反应的DNA模板量进行考察，DNA模板量在3～100 ng广地龙均可以扩增出特异性条带，沪地龙3种品种及大腔蚓均呈阴性，见图3C～D。由图可见，随着DNA模板量的增加，条带的亮度增加，其中3、5 ng的扩增带较弱，适合的DNA模板量为10～100 ng。对25 μL PCR反应体系中的Taq聚合酶的用量进行考察，Taq聚合酶量为0.625～2.5 U，3个酶浓度下广地龙都可获得清晰、明亮的条带，其余样品则呈阴性，见图3E。为了节约成本，最终确定0.625 U为25 μL PCR体系Taq聚合酶的加入量。

3.4 广地龙特异性引物的鉴别结果

确定PCR扩增条件以后对37个批次地龙药材和混伪品进行PCR扩增。采用广地龙特异性引物PA-f/PA-r对14批次广地龙(7批广西产和7批广东产)进行扩增，PCR鉴别图如图4所示；对4批广地龙、6批通俗环毛蚓和4批威廉环毛蚓进行PCR扩增，结果见图5；对3批广地龙、3批栉盲环毛蚓、6批大腔蚓，其他动物(水蛭、蜈蚣、僵蚕、蝉蜕等)进行PCR扩增，PCR鉴别结果见图6。

由图4可见，14批广地龙样品均可扩增出条带，序列长度在574 bp左右，广西产和广东产的地龙条带整齐、清晰，未见明显差异。由图5可见，只有4批广地龙样品呈阳性，可以扩增出清晰条带，大小约574 bp，6批通俗环毛蚓和4批威廉环毛蚓地龙样品呈阴性，无条带扩增；由图6可见，只有3批广地龙可以扩增出条带，3批栉盲环毛蚓、6批大腔蚓地龙样品呈阴性，无条带扩增，水蛭、蜈蚣、僵蚕、蝉蜕其他动物样品也呈阴性。实验结果表明，设计的特异性引物可以区分广地龙及3种沪地龙，也可以区分广地龙及其他动物品种(蜈蚣、僵蚕、水蛭等)。

4 讨论

临床入药的地龙品种大多是广地龙，但是目前市场上地龙品种繁杂，常有广地龙的伪品混入其中，影响临床用药。地龙品种的传统鉴定受到加工方式及程度的影响，性状鉴定要求药材保存完好，药材破损情况下，性状鉴别非常困难，此外还需专业人员和专业的仪器设备才能鉴定。本文设计广地龙的特异性引物，进行广地龙的DNA条形码鉴定，对药材保存要求较低，而且药材用量很少，并且对药材部位没有要求，能提出DNA即可鉴定出是否为广地龙品种。广地龙品种的确定，为地龙临床用药提供了有效的方法。

目前动物药DNA条形码鉴别中，使用的基因片段有COⅠ、16SrRNA和12SrRNA序列，其中COⅠ序列最为常见。在预实验中，对COⅠ、16SrRNA和12SrRNA 3对引物都进行了考察，发现使用COⅠ序列扩增的条带比16SrRNA和12SrRNA序列更清晰。故本文选择COⅠ序列作为地龙药材的扩增引物。本文在COⅠ序列的基础上扩增了广地龙及混伪品，并对PCR扩增产物进行DNA测序，将广地龙及混伪品的DNA序列进行比对，找出差异位点，设计了广地龙的特异性引物PA-f/PA-r。引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。本实验设计的广地龙特异性引物PA-f/PA-r长度为25 bp左右，G+C含量约50%，避免了因G+C太少扩增效果不佳或G+C过多易出现非特异条带的情况。引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第2个碱基，严格配对，避免了因末端碱基不配对而导致PCR失败。

酶是PCR扩增的关键因子，酶质量的好坏，浓度的大小直接影响着扩增的效果。本文选择常用的Taq聚合酶，具有耐高温(95 ℃)的特性，酶浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少，通过对酶量的考察，确定25 μL PCR反应体系中酶的用量为0.625 U。DNA模板的浓度直接影响扩增的重复性、特异性和扩增的产量。过量的模板导致错配机率增高、非特异性增大，模板太少，扩增产物重复性不佳、难以检出。通过对DNA模板量的考察，最适宜的DNA模板量为10～100 ng。此外，对影响PCR特异性鉴别的其他重要因素退火温度和循环次数等进行了考察，确定了PCR反应适宜的条件范围，最终建立了广地龙特异性PCR鉴别方法。

本论文设计得到的引物PA-f/PA-r具有较好的特异性，可快速、准确地鉴别广地龙基原的真实性，可以区分广地龙和3种品种的沪地龙，也可以准确鉴别广地龙和伪品地龙(海南大腔蚓)及其他动物品种(蜈蚣、僵蚕、水蛭等)，为广地龙品种鉴定提供有效方法。