何钰，许海燕，单进军，赵霞，沈存思，纪建建，林丽丽，杨瑞，谢彤，汪受传

(1.南京中医药大学，江苏省儿童呼吸疾病(中医药)重点实验室，江苏 南京 210023；2.南通市疾病预防控制中心微生物检验科，江苏 南通 226007)

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染诱发的肺炎(COVID-19)引发严重的全球性公共卫生事件。截至北京时间2020年4月2日13:00，全球NCP累积确诊病例937 567例，死亡47 256例，涉及180个国家和地区[1]。

中国成功遏制了疫情蔓延，取得阶段性成果，为国际社会提供重要借鉴，其中中医药发挥的力量不可小觑，特别是阻止病情继续扩大以及缩短疾病治疗时程等方面方面发挥了极其独特的积极作用。金欣口服液是在麻杏石甘汤的基础上加减所得，大量研究结果显示其治疗病毒性肺炎效果显著[2-3]。中药方剂成分复杂，具有多靶多效特点[4]，注重从整体观上对病证辨证施治。网络药理学技术选取信号节点进行多靶点药物分子设计，与中医药多靶点、整体效应相符合[5-7]。本研究旨在利用网络药理学探究金欣口服液治疗COVID-19的可能性和潜在靶点，为金欣口服液更广泛地应用于临床提供理论依据。

1 方法

1.1 筛选类药性成分及其作用靶点

基于中药系统药理数据库和分析平台(TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)查询配伍药物麻黄(Ephedra herba)、苦杏仁(Amygdalus communis vas)、黄芩(Scutellariae radix)、葶苈子(Lepidii semen descurainiae semen)、桑白皮(Mori cortex)、前胡(Peucedani radix)和虎杖(Polygoni cuspidati rhizoma et radix)的物质组成分，以口服生物利用度(Oral bioavailability,OB)≥30%、成药相似性(Drug likeindex,DL)≥0.18为标准筛选合适的类药成分。通过PubChem获取化学结构标准的SMILES信息以及InChIKeys信息。以ClassyFire化学结构分类器(https://cfb.fiehnlab.ucdavis.edu)对得到的化学结构进行结构分类。数据可视化通过sunburst R包实现。

1.2 疾病对应靶点的收集

疾病对应的靶点通过DisGeNET数据库(https://www.disgenet.org/)收集。以疾病对应的MeSH标准主题词为关键词，在数据库中搜索疾病对应的靶点。所选择MeSH标准主题词及其对应的疾病ID号分别为：严重急性呼吸综合征C1175175(Severe acute respiratory syndrome,SARS)、中东呼吸症候群冠状病毒感染症C3694279(Middle east respiratory syndrome,MERS)、呼吸道合胞病毒C0035235(Respiratory syncytial virus infection,RSV)和肺炎C0032285(Pneumonia)。

1.3 潜在治疗靶点互作网络的构建

所有的靶点基因和靶点蛋白通过Uniport(https://www.uniprot.org/)数据库进行注释标准化。将金欣口服液中类药性成分相关的靶点和疾病相关的靶点进行匹配，筛选出具有交互性的治疗靶点基因。将筛选得到的靶点基因输入STRING数据库(https://string-db.org/)进行蛋白质互作分析，构建蛋白质相互作用网络图。数据可视化通过venn R包实现。

1.4 基因本体分析和代谢通路分析

筛选得到的基因靶点输入DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)进行差异基因的基因本体功能注释和代谢通路分析，特征地识别和分析潜在靶点。从结果中挖掘FDR值小于0.05，且基因本体注释语句与肺炎直接相关的基因本体和代谢通路。构建化合物→基因→基因本体通路的网络构建，通过CytoScape软件(https://cytoscape.org)实现。

2 结果

2.1 金欣口服液的效应成分分析

根据TCMSP数据库查询到金欣口服液成方中七种中药的物质组成分共962种，以OB≥30%且DL≥0.18为筛选标准得到129个类药性成分。韦恩图的结果表明，金欣口服液中类药性的成分主要集中在前胡、桑白皮、麻黄以及苦杏仁中(图1A～B)。化学结构分类结果表明，类药性成分主要分布在黄酮大类和脂类成分，黄酮大类包括黄烷酮类、黄酮类以及甲基化黄酮类，脂质类成分主要包括固醇及甾体类、异戊烯醇脂、脂肪酰类(图1C～D)。筛选的具体结果见表1。

表1 金欣口服液物质成分化学分类结果

2.2 金欣口服液治疗新型冠状病毒的潜在靶点

通过TCMSP数据库筛选出类药成分对应的靶点共268个。新型冠状病毒是一种单链RNA正链包膜β冠状病毒，与SARS、MERS相似，基因组序列分别具有79%和50%的同源性[8]，因此选择SARS和MERS所对应的疾病为关键词在DisGeNET搜索疾病相关靶点。由于金欣口服液在治疗RSV肺炎方面疗效显著，因此我们将RSV肺炎也作为关键词纳入筛选标准。共挖掘到疾病相关靶点基因805个。整合类药成分相关靶点基因和疾病相关基因，挖掘出金欣口服液可能用于治疗新型冠状病毒肺炎的潜在靶点共75个(图2)。

2.3 潜在治疗靶点的蛋白质互作分析

75个靶点基因输入数据库，以互作得分>7.0作为筛选标准进行蛋白质互作分析。共得到75个节点和527条相互作用线，蛋白质相互作用富集P<0.01。采用K-means聚类算法对蛋白质相互作用网络进行聚类分析，聚类结果以Uniport关键词和Reactome信号通路注释条目表示(图3，表2)。

2.4 基因本体分析和KEGG通路分析

将靶基因输入DAVIDA数据库进行基因本体分析和代谢通路分析。以富集的FDR值<0.05筛选基因本体(Gene ontology,GO)数据和KEGG代谢通路数据。共挖掘到生物过程(Biological process,BP)注释条目45个、细胞组成(Cellular component,CC)条目12个、分子功能条目(Molecular function,MF)19个、KEGG代谢通路分析(KEGG pathway)条目66个，从中挖掘与抗病毒免疫以及炎症应答相关的注释条目绘制气泡图(图4)，并进一步构建化合物→基因→富集通路图(图5)。

3 讨论

新型冠状病毒肺炎在中医理论上属于疫病、瘟疫的范畴[9]，临床上以清热、解毒、化湿为主。金欣口服液在麻杏石甘汤的基础上加减所得，全方宣肺开闭、清热解毒、化痰止咳、除湿,治疗病毒性肺炎有显著疗效[10]。本研究利用网络药理学共筛选出金欣口服液中129种类药性成分，包括苯丙素类83种、脂类成分27种、苯环型化合物6种、有机氧化合物7种等。报道指出天然植物中的黄酮类成分高效低毒，具有良好的体内外抗多种病毒活性，能有效预防和治疗病毒性感染[11]。

筛选到的类药成分-疾病交互的靶点75个，进行进一步的蛋白质互作的关联网络分析。根据相似度算法可将关联网络中各个节点聚类成不同社区(Community)。实验结果显示：炎症因子相关的靶点聚类在同一个社区内，如IL-1A、IL-1B、IL-10等(图3中红色靶点)，信号转导通路相关靶点聚集在同一个社区内，如MAPK和JUN等(图3中蓝色靶点)。对蛋白质互作靶点进行富集分析，Uniport关键词富集分析发现，互作主要富集在细胞因子、蛋白质-病毒相互作用、炎症应答等。Reactome信号通路数据库收集了关于蛋白质相互作用的信息。Reactome信号通路富集结果显示，靶点基因主要富集到白细胞介素和免疫炎症因子通路上，表明金欣口服液中的类药成分有可能通过抗病毒免疫发挥抗COVID-19的作用。

利用75个靶点基因进行GO分析和KEGG代谢通路分析，发现基因靶点富集在抗病毒免疫以及抗炎的生物过程和代谢通路上。如KEGG代谢通路富集在T细胞受体细胞通路、B细胞信号受体通路、Toll样受体信号通路、NOD样信号受体通路等。BP条目主要富集在炎症响应通路、氧化还原过程、NF-κB信号通路、MAPK信号通路等。此外，富集到G-蛋白偶联受体生物与趋化因子表达相关。肺部在受到病毒侵袭时，往往会激发机体的固有免疫或获得性免疫[12-15]。本研究结果显示，金欣口服液中的类药性成分可能通过发挥抗病毒免疫和抗炎作用，从而具有潜在的治疗COVID-19的疗效。

通过化合物→基因→通路注释关联网络分析，节点度最高的两个靶点基因P35354和P23219分别对应于为前列腺素G/H合酶2和前列腺素G/H合酶1，节点度最高的两个类药化合物MOL000098、MOL000422分别对应于槲皮素和山奈酚，由此说明金欣口服液通过抗炎发挥抗病毒功效。本次抗疫情过程中，提到“炎症风暴”是新冠状病毒患者从轻症向重症转化的重要节点。炎症风暴引起机体免疫损伤，引起体液中多种细胞因子产生，是引起多器官衰竭的重要原因[16]。由网络药理学结果显示，金欣口服液具有抗炎抗病毒免疫的作用，提示金欣口服液在间接抗病毒方面，用于新型冠状病毒肺炎患者，恢复机体整体功能具有一定的可行性。

网络药理学通过挖掘数据库中的信息，从整体、多靶角度阐述中药复方可能作用的环节，为中医药科学研究提供指导。本研究基于网络药理学挖掘出金欣口服液中可能发挥用于治疗COVID-19的基因靶点，为后期验证工作提供相应的理论依据。需要指出的是，网络药理学的研究多基于数据库进行数据挖掘，而数据的信息往往来源于文献，因此一些热点化合物和靶点基因在分析过程会被富集，而一些强效的特异性化合物信息可能会丢失。在后期的研究中，应基于复方特色和化合物结构特点，选择性开展验证工作。