刘静，蔡皓，段煜，裴科，周佳，张雅婷，莫子晴，钮敏洁

(1．南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023；2．南京中医药大学国家教育部中药炮制规范化及标准化工程研究中心，江苏 南京 210023；3．山西中医药大学制药与食品工程学院，山西 太原 030024)

四逆散(Sinisan，SNS)由柴胡、白芍、枳实和炙甘草组成，源于张仲景《伤寒论》。研究表明，SNS能够显著改善抑郁模型大鼠的抑郁状态[1]。本研究将醋柴胡(柴胡的炮炙品)和醋白芍(白芍的炮炙品)与枳实和炙甘草配伍，形成醋炙品组方四逆散(Vinegar-processed Sinisan，VPSNS)。由课题组前期实验研究可知，VPSNS也同样具有抗抑郁作用。但SNS和VPSNS抗抑郁的机制目前尚未明确。

脑源性神经营养因子(BDNF)在抑郁症中发挥着非常重要的作用。环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)与学习记忆分子神经机制的关系特别受到关注，其参与介导依赖Ca2+的BDNF表达。此外，在抑郁的发展过程中，细胞外调节蛋白激酶(ERK)信号在抑郁相关的大脑区域被破坏。由此我们推测，BDNF-ERK-CREB信号系统可能参与了抑郁症的分子机制。

基于此，课题组拟通过对损伤指标和抑郁指标的检测，探讨皮质酮(CORT)致PC12细胞模型作为体外抑郁模型的科学性并探讨SNS以及VPSNS减轻CORT导致的PC12细胞损伤的分子机制。

1 材料

1.1 动物与细胞系

SPF级SD大鼠，雄性，体质量(180±20)g，由浙江省医学科学院提供，许可证号：SCXK(浙)2019-0002；高分化PC12细胞购于上海赛百慷公司。

1.2 药物与试剂

柴胡饮片(产地：甘肃，批号：20161101)，白芍饮片(产地：安徽，批号：20161001)，枳实饮片(产地：江西，批号：20160901)和炙甘草饮片(产地：内蒙古，批号：20160801)均购自安徽铜陵禾田中药饮片有限公司，经检测均符合2015版《中国药典》(一部)各饮片项下的质量规定。醋柴胡饮片和醋白芍饮片均采用上述对应批号的柴胡饮片和白芍饮片按照2015版《中国药典》(四部)炮制至规定程度。

MTT(北京Solarbio公司，批号：M8180-250)；胎牛血清(美国Gibco公司，批号：10099141)；青霉素-链霉素溶液(美国Gibco公司，批号：BL505A)；PBS缓冲液(德国Hyclone公司，批号：lw-sh30256.01)；胰酶(美国Gibco公司，批号：C0205)；DMSO(美国MPBIO公司，批号：D4540-500ML)；CORT(北京Solarbio公司，批号：HY-B1618)；RIPA细胞裂解液(碧云天生物技术有限公司，批号：P0013B)；大鼠ELISA试剂盒(南京金益柏生物科技有限公司，批号：201909)；超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20190910)；乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20190912)；RPMI 1640培养基(美国Gibco公司，批号：C11995500BT)；蛋白浓度检测试剂BCA液(美国Thermo公司，批号：EE60997A)；细胞凋亡检测试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司，批号：KGA1023-1026)；总RNA快速提取试剂(含RNApure)(南京翼飞雪生物科技有限公司，批号：YFXM0011P)；氯仿(中国国药集团化学试剂有限公司，分析纯，批号：20180611)；异丙醇(上海申博化工有限公司，批号：XK13-011-00011)；DEPC水(上海碧云天生物技术有限公司，批号：R0021)；2×SYBR Green Fast qPCR Master Mix(南京翼飞雪生物科技有限公司，批号：YFXM001)；cDNA第一链快速合成试剂盒(去基因组)(南京翼飞雪生物科技有限公司，批号：YFXM0012-100)。

1.3 仪器

Zeiss Axion A1倒置显微镜(德国Zeiss公司)；INE600 CO2培养箱(德国MEMMERT公司)；低速离心机(中国湘仪离心机仪器公司)；BioRad Model 550型酶标仪(美国Bio-Rad公司)；流式细胞仪(美国BD公司)；XW-80A旋涡振荡器(中国海门其林贝尔仪器制造有限公司)；ST 16R高速冷冻离心机(美国Thermo Sorvall公司)；移液器(德国Eppendorf公司)；CFX Connect荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 样品的制备

2.1.1 供试品溶液的制备 按照SNS的处方比例(1∶1∶1∶1)，分别称取柴胡饮片6.0 g，白芍饮片6.0 g，枳实饮片6.0 g和炙甘草饮片6.0 g，置同一圆底烧瓶中，加6倍量的蒸馏水回流提取1.5 h，过四层纱布滤出药液，残渣再加4倍量的蒸馏水回流提取1 h，过四层纱布滤出药液，合并2次所得药液，于旋转蒸发仪减压浓缩至药物浓度为0.1 g/mL，即得SNS的供试品溶液，置冰箱保存供大鼠灌胃用。

分别称取醋柴胡饮片6.0 g，醋白芍饮片6.0 g，枳实饮片6.0 g和炙甘草饮片6.0 g，采用上述SNS供试品溶液制备的同样方法制得VPSNS的供试品溶液，置冰箱保存供大鼠灌胃用。

2.1.2 含药血清的制备 SD大鼠(n=6)适应性饲养3 d后，连续灌胃给药3 d，早晚各1次，给药剂量为成年人临床剂量的6倍[2]，采血前禁食不禁水12 h以上。末次给药1 h后，常规乙醚麻醉。麻醉后腹主动脉取血，37 ℃静置1 h，3 000 r/min离心10 min，分离血清，加入10 mL无菌离心管。56 ℃水浴锅灭活30 min后于细胞房中75%酒精消毒，血清用0.22 μm微孔滤膜除菌，于-80 ℃保存备用。

2.2 细胞培养和形态学观察

PC12细胞培养于含有10%胎牛血清和1%双抗的RPMI 1640培养基中，置37 ℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养。细胞贴壁生长，取对数生长期细胞用于实验。

6孔板观察细胞形态，每孔细胞数5×104个，种板体积1 mL，孵育箱中孵育24 h后，给予不同浓度(100、200、300、400、500、600 μmol/L)的CORT溶液，给药体积500 μL。分别继续孵育24、36、48 h后，于显微镜下观察拍照。

2.3 细胞给药及分组

2.3.1 CORT条件筛选分组 取对数生长期PC12细胞，消化、计数，以每孔1×104个的密度接种于96孔板中，每孔200 μL。培养24 h后，弃去上清，200 μL PBS洗2遍。给予不同浓度(100、200、300、400、500、600 μmol/L)的CORT溶液，每个浓度6个复孔，同时设置6个调零孔，内加培养液。药物分别作用24、36、48 h。

2.3.2 含药血清浓度的确定 细胞处理方法同2.3.1。分为空白对照组(200 μL全培)、CORT组(500 μmol/L CORT)、SNS血清组(浓度分别为2.5%、5%、10%、20%、40%)和VPSNS血清组(浓度分别为2.5%、5%、10%、20%、40%)。每个浓度6个复孔，同时设置6个调零孔，内加培养液。

2.3.3 药效实验 细胞处理方法同2.3.1。分为空白对照组(200 μL全培)、CORT组(500 μmol/L CORT)、SNS血清组(100 μL 20%SNS血清+100 μL 500 μmol/L CORT)和VPSNS血清组(100 μL 20%VPSNS血清+100 μL 500 μmol/L CORT)，每个浓度6个复孔，同时设置6个调零孔，内加培养液。

2.4 MTT法检测细胞活力

2.3.1和2.3.2实验结束后，弃去上清，每孔加入200 μL 0.5 mg/mL MTT，孵育4 h后，弃去上清，加入150 μL DMSO，摇床上摇晃10 min，用酶标仪在490 nm处测定吸光度值。

2.5 ELISA法检测抑郁指标

将PC12细胞培养24 h，按2.3.3项下进行给药处理后，用无菌管收集200 μL细胞上清液，于4 ℃离心机中3 000 r/min离心20 min。收集各组上清液，用ELISA试剂盒检测多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)含量。

2.6 WST-1法检测损伤指标

将细胞按2.3.3项下进行给药处理后，用无菌管收集，离心20 min左右(2 000～3 000 r/min)。收集各组上清液，用WST-1法检测LDH含量和SOD活力。

2.7 流式细胞术检测细胞凋亡率

按2.3.3项下给药后，用不含EDTA的胰酶消化细胞，终止消化后，1 500 r/min离心3 min，吸去上清，用PBS洗1遍，离心后用PBS重悬细胞，进行细胞计数。每样本细胞数为5×105mL-1，离心去上清，加入500 μL Bing buffer重悬细胞。枪头反复吹吸混匀细胞，加入7-ADD以及Annexin V-APC染液各5 μL，室温避光孵育15 min。PBS洗涤2次，流式细胞仪检测细胞凋亡数。

2.8 Western blot检测蛋白表达

按2.3.3项下给药后，收集细胞，每孔加入100 μL RIPA裂解液(含蛋白酶抑制剂及PMSF各10 μL)，振荡器震荡30 s，超声裂解细胞15 min后，12 000×g，4 ℃离心20 min，取上清，BCA检测蛋白浓度，加入蛋白上样缓冲液煮沸，每孔上样50 μg，SDS-PAGE电泳，将蛋白经湿转缓冲液转至PVDF膜上，5%BSA封闭3 h，一抗4 ℃孵育15 h，TBS洗涤1次，二抗孵育2 h后ECL发光液压片显色，GAPDH为内参。

2.9 qPCR检测基因表达

采用Triozol法提取RNA，以提取的细胞总RNA为模板，按照逆转录试剂盒说明书，逆转录合成cDNA，采用SYBR法进行检测。ERK1上游引物序列：5'-GCCAGTGGCCGAGGAACCTTTC-3'，下游引物序列：5'-GCTGGAAGCGGGCTGTCTCCT-3'；ERK2上游引物序列：5'-GTTCCCCGAACGCGGACTCCAAAG-3'，下游引物序列：5'-ATCCCGGCTGGAATCGAGCAGTC-3'；CREB上游引物序列：5'-CTGAGGAGCTTGTACCACCG-3'，下游引物序列：5'-AATCTGTGGCTGGGCTTGAA-3'；BDNF上游引物序列：5'-CTCCTCTGCTCTTTCTG-3'，下游引物序列：5'-GACCCACTCGCTAATAC-3'；GAPDH上游引物序列：5'-CAAGTTCAACGGCACAGTCAAG-3'，下游引物序列：5'-ACATACTCAGCACCAGCATCAC-3'。ERK1、ERK2和GAPDH为两步法延伸，延长温度为56.5 ℃，即初始95 ℃、10 s，56.5 ℃、45 s，合计40个循环；CREB和BDNF为三步法，初始95 ℃、10 s，55 ℃、30 s，70 ℃、45 s，合计40个循环。引物由南京翼飞雪生物科技有限公司合成，GAPDH为内参。

2.10 统计学方法

3 结果

3.1 CORT造模条件及含药血清浓度的研究

3.1.1 形态学观察 显微镜下，正常的PC12细胞呈多边形，贴壁生长，轴突清晰可见，胞体较大，细胞数目较多，如空白对照组所示(图1)。损伤的PC12细胞随CORT浓度的不同呈现出不同程度的损伤甚至死亡，轴突不明显，贴壁性减弱。死亡细胞完全不贴壁,呈圆形。给予不同浓度的CORT 24、36、48 h后的结果分别如图1所示。500 μmol/L CORT所致PC12损伤的药效最强，细胞全部死亡，视野中无贴壁细胞。当CORT浓度增加到600 μmol/L时，视野中又出现贴壁、有轴突的细胞。

3.1.2 最佳CORT给药浓度和时间的研究 如图2所示，CORT致PC12细胞损伤的最佳浓度和时间为500 μmol/L和36 h，与形态学观察结果一致。

3.1.3 含药血清浓度的确定 由图3可知，SNS血清组和VPSNS血清组的最佳给药浓度均为20%。

3.2 各组细胞上清液中DA、5-HT、TNF-α和IL-1β含量的比较

与空白对照组相比，CORT组DA、5-HT含量下降(P<0.05)；与CORT组相比，20%SNS血清组和20%VPSNS血清组DA、5-HT含量均有上升(P<0.05)；与20%SNS血清组相比，20%VPSNS血清组DA、5-HT含量显著增加(P<0.05)。见表1。

表1 各组DA和5-HT含量的比较

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与CORT组比较，#P<0.05；与SNS血清组比较，△P<0.05。

与空白对照组相比，CORT组的TNF-α、IL-1β含量升高(P<0.05)；与CORT组相比，20%SNS血清组和20%VPSNS血清组的TNF-α、IL-1β含量均有下降(P<0.05)；与20%SNS血清组相比，20%VPSNS血清组TNF-α、IL-1β含量明显增加(P<0.05)。结果见表2。

表2 各组炎症因子TNF-α和IL-1β含量的比较

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与CORT组比较，#P<0.05；与SNS血清组比较，△P<0.05。

3.3 各组细胞上清液中LDH含量和SOD活力的比较

与空白对照组相比，CORT组的LDH含量增加(P<0.05)；与CORT组相比，20%SNS血清组和20%VPSNS血清组的LDH含量均有减少(P<0.05)；与20%SNS血清组相比，20%VPSNS血清组的LDH含量显著减少(P<0.05)。

与空白对照组相比，CORT组的SOD活力减少(P<0.05)；与CORT组相比，20%SNS血清组和20%VPSNS血清组的SOD活力均显著增加(P<0.05)；与20%SNS血清组相比，20%VPSNS血清组SOD活力显著增加(P<0.05)。结果见表3。

表3 各组损伤因子LDH含量和保护因子SOD活力的比较

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与CORT组比较，#P<0.05；与SNS血清组比较，△P<0.05。

3.4 各组细胞凋亡率比较

结果如图4和表4所示。与空白对照组相比，CORT组的细胞凋亡率显著升高(P<0.05)；与CORT组相比，20%SNS血清组和20%VPSNS血清组的细胞凋亡率均有降低(P<0.05)；与20%SNS血清组相比，20%VPSNS血清组的细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。

3.5 各组Western blot检测蛋白表达的比较

表4 各组细胞凋亡率比较

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与CORT组比较，#P<0.05；与SNS血清组比较，△P<0.05。

由图5～6可知，与空白对照组相比，CORT组的BDNF、ERK、p-ERK、CREB和p-CREB蛋白表达均有下降(P<0.05)；与CORT组相比，20%SNS血清组和20%VPSNS血清组的BDNF、ERK、p-ERK、CREB和p-CREB蛋白表达均有上升(P<0.05)；与20%SNS血清组相比，20%VPSNS血清组的BDNF、ERK、p-ERK、CREB和p-CREB蛋白表达显著增加(P<0.05)。

3.6 各组qPCR检测基因表达的比较

由图7可知，与空白对照组相比，CORT组的BDNF、ERK和CREB基因表达均有下降(P<0.05)；与CORT组相比，20%SNS血清组和20%VPSNS血清组的BDNF、ERK和CREB基因表达均有上升(P<0.05)；与20%SNS血清组相比，20%VPSNS血清组的BDNF、ERK和CREB基因表达显著增加(P<0.05)。

4 讨论

目前，具有典型的神经元和糖皮质激素受体特征的PC12细胞，已被广泛应用于研究神经元损伤的体外模型[3-5]。研究表明，抑郁症患者“下丘脑-垂体-肾上腺”(HPA)轴的活跃会最终导致CORT含量的升高，而CORT含量的升高是抑郁症发生机制的一个终点性变化指标。已有实验发现抑郁症大鼠中的促肾上腺皮质激素(ACTH)和CORT浓度显著增加，表明抑郁症大鼠HPA轴亢进，推测这可能是抑郁症的发病机制之一[6-8]。CORT为抑郁细胞实验的一个常用模型药物[9]。抑郁症发病机制复杂，有多种假说，其中单胺类神经递质假说有众多的研究支持，参与抑郁症过程的单胺类神经递质有5-HT和DA等[10]。姚辉等[10]通过对医院就诊抑郁症患者治疗前后细胞因子的水平变化，得出就诊前患者IL-1β水平高于正常人水平，经过4周治疗后，患者的细胞因子水平显著降低。叶晓楠等[11]研究发现，SNS可改善慢性刺激所致的抑郁症大鼠睡眠，全脑TNF-α水平增加，认为SNS对TNF-α信号通路的调节可能是SNS治疗抑郁的机制之一。SOD是一种源于生命体的活性物质，能够消除细胞新陈代谢的产物，并有减小细胞损伤和氧化的作用。LDH是一种能够催化乳酸脱氢生成丙酮酸的酶。当细胞损伤时，LDH大量溢出，SOD则对细胞损伤具有保护作用。

虽然单胺类神经递质假说在抑郁症发病机制假说中被广泛接受，但同时也有越来越多的学者研究证明了炎症因子与抑郁症发病的相关联系。文献表明，分化PC12细胞具有神经性，很多学者用CORT致PC12细胞损伤来进行体外抑郁研究，但是CORT作用前后的相关抑郁指标变化并没有学者进行相关阐述。在本研究中，CORT组与空白对照组相比，DA、5-HT、TNF-α和IL-1β的含量均有降低，且5-HT、TNF-α和IL-1β的含量变化具有显著性差异(P<0.05)，从单胺类神经递质假说和炎症细胞因子假说这2个角度来看，显示出CORT作用于PC12细胞用于研究体外抑郁实验具有一定的科学性。

有学者将抑制PC12细胞凋亡的作用作为抗抑郁活性成分的筛选[12]。在本实验研究中，20%SNS血清组和20%VPSNS血清组的细胞凋亡率均有所降低，且20%VPSNS血清组的细胞凋亡率小于20%SNS血清组的细胞凋亡率，提示SNS和VPSNS的抗抑郁作用可能与其抗细胞凋亡作用有关，且VPSNS的抗细胞凋亡作用优于SNS的抗细胞凋亡作用，其具体机制还需进一步深入研究。有学者研究发现，BDNF的表达与抑郁症的发生密切相关[13]。BDNF可促进5-HT神经元的存活和分化[14]。在BDNF的控制下，CREB在调节运动诱导的学习和记忆增强方面具有功能作用[15]。有研究发现，L型VSCCs介导了Ca2+的内流，而Ca2+通过CREB家族依赖机制刺激了BDNF启动子Ⅲ的转录[16]。这些研究结果表明，BDNF是CREB家族转录因子的一个关键靶点，可能介导了CREB家族对突触功能的影响。p-CREB是CREB的磷酸化活化形式。最近的一项研究预测，哺乳动物基因组中可能有多达10 000个CREB结合位点，例如，BDNF和促肾上腺皮质激素释放因子等分子含有CREs[17]。根据细胞类型或大脑区域的不同，CREB磷酸化的持续时间可能不同。也有研究表明，Aβ可通过调节p-CREB来降低BDNF转录[18]。CREB的激活是通过一个特定的丝氨酸(Ser133)残基的磷酸化介导的。这种磷酸化可以促进CREB与CREB结合蛋白的结合，CREB结合蛋白是一种辅助激活蛋白，可以帮助转录复合物的装配，从而激活靶基因[19]。ERK信号通路的缺陷与抑郁行为的表现有关[20]。ERK包括ERK1和ERK2。有研究表明，参与了抑郁症神经机制的ERK-CREB信号系统可能是氟西汀抗抑郁作用的靶点[21]。BDNF是ERK的直接上游调节因子[22]。同时，海马内Raf/ERK/RSK/CREB信号通路可能参与了耳甲电针的抗抑郁效应[23]。本实验结果显示，SNS和VPSNS均具有一定的抗抑郁作用，此作用可能是通过调控BDNF-ERK-CREB通路实现的。