杨金伟,赵灿，刘秀，吴勇军，喻嵘,

(1.湖南中医药大学第一中医临床学院，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学研究生院，湖南 长沙 410208；3.中医方证研究转化医学湖南省重点实验室，湖南 长沙 410208；4.湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208)

糖尿病动脉粥样硬化是糖尿病主要的大血管并发症之一，其主要的病理改变是动脉粥样硬化斑块的形成，而巨噬细胞泡沫化和凋亡是导致斑块形成的重要因素，加速动脉粥样硬化性血管疾病的进展的主要原因[1]。机体长期糖脂代谢紊乱、胰岛素抵抗及慢性炎性反应激活巨噬细胞内质网应激反应(ERS)[2]。过度的ERS可激活C/EBP环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白(CHOP)和半胱氨酸蛋白酶蛋白-12(Caspase-12)等信号途径诱导巨噬细胞凋亡，进一步刺激粥样斑块的形成[3]。研究发现，巨噬细胞ERS过程中，PERK/eIF2α/ATF4信号可能参与了巨噬细胞不可逆损伤及功能降低，对泡沫化及凋亡进程具有关键调控作用[4]。以滋阴益气、活血解毒立法组成左归降糖舒心方(由黄芪、生地、丹参、山茱萸等9味药组成)为基础方左归复方的增减方，具有改善糖脂代谢和减少炎症因子对细胞损伤的作用，减缓糖尿病并发血管病变的风险，其作用机制与减轻炎症反应、内质网应激损伤相关[5-6]。本研究利用氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导巨噬细胞J774A.1泡沫化及ERS，进一步探索左归降糖舒心方含药血浆对ERS关键信号通路PERK/eIF2α/ATF4和ERS凋亡相关蛋白CHOP、Caspase-12表达的影响。

1 材料

1.1 动物与细胞株

8周龄SD雄性大鼠30只，体质量180～220 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK(湘)2016-0006。于湖南中医药大学东塘校区SPF级实验动物中心饲养。放置于温度(22±2)℃及湿度50%～65%恒定的环境中。自由饮食，自由饮水，光/暗周期为12 h/12 h(光照时间为6:00-18:00)；小鼠J774A.1巨噬细胞购自于湖南丰晖生物科技有限公司。

1.2 药物

左归降糖舒心方由黄芪、生地、丹参、山茱萸等9味药物构成，所有药材均购自于湖南中医药大学第一附属医院门诊中药房，以5倍药材量的单蒸水浸泡1 h，煮沸后以小火煎煮30 min，过滤后取汁；药渣再加3倍量的单蒸水煎煮20 min，过滤取汁。2次药汁混合，在恒温水浴中旋转蒸发浓缩制备成含生药质量浓度为2 g/mL的药液，经灭菌后置于4 ℃冰箱中保存备用。二甲双胍片：规格0.25 g×12片，浙江亚太药业股份有限公司，批号：17061412；阿托伐他汀钙片：规格20 mg×7片，北京嘉林药业股份有限公司，批号：190607；牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)：上海源叶生物有限公司，批号：T29M7T12089。

1.3 试剂与仪器

胎牛血清，美国GIBCO公司；胰蛋白酶-EDTA消化液，北京Solarbio公司；DMSO，美国Amresco公司；CCK-8，日本同仁公司；ox-LDL，广州奕源生物有限公司；牛血清白蛋白，瑞士Roche公司；Alexa Fluor©488标记山羊抗兔IgG二抗，中杉金桥生物技术有限公司；p-PERK、p-eIF2α、ATF4及Caspase-12、CHOP多克隆抗体，Abcam公司。SW-CJ-2G超净工作台，美国Thermo公司；冷冻高速离心机，美国Thermo公司；Milli-Q Advantage纯水装置，美国Milipore公司；ELx800酶标仪，美国BioTek公司；AE 31型倒置显微镜，厦门Motic公司。

2 方法

2.1 细胞培养

小鼠J774A.1巨噬细胞以含10%胎牛血清，90%DMEM的完全培养基(含100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、25 mmol/L葡萄糖)在37 ℃、5%CO2,培养箱中分化。2～3 d更换1次培养液，显微镜观察细胞形态，待细胞体积明显增大，向四周伸出足突，分化成熟的细胞用于实验。

2.2 含药血浆的制备

将30只SD大鼠按照随机原则分成3组：空白血浆组、左归降糖舒心方组、西药联合(二甲双胍联合阿托伐他汀钙)组，每组10只。按照临床70 kg成人剂量的5倍给药，左归降糖舒心方组药物浓度为2 g/mL，灌胃量为22.5 mL/(kg·d)；二甲双胍灌胃剂量为0.45 g/(kg·d)，阿托伐他汀钙灌胃剂量为1.8 mg/(kg·d)；空白血浆组采用等剂量的灭菌超纯水灌胃。连续灌胃5 d，对于每天灌胃总量超4 mL的组分2次给药，取血前12 h予以撤食不撤水，末次灌胃1 h后，予以麻醉，腹主动脉取血，用含EDTA抗凝管收集血液，3 000 r/min离心15 min，用吸管取上层血浆，0.22 μm滤膜过滤，56 ℃恒温水浴锅灭活30 min，将灭活的血浆分装至无菌EP管中，置于-80 ℃保存。

2.3 CCK-8检测J774A.1巨噬细胞增殖抑制率

取处于对数期生长的J774A.1细胞，经胰酶消化后，加入10%FBS DMEM完全培养液重悬细胞，经血球计数板计数后，用10%FBS DMEM完全培养液将细胞密度调成5×104mL-1，加至96孔培养板中，每孔100 μL，放入37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中，用预冷的培养液将细胞同步化处理后，分别加入25、50、100、150、200 mg/L的ox-LDL或10%含药血浆干预培养J774A.1细胞24 h，以10%FBS DMEM培养的细胞为正常对照组，每组均设5个复孔。待分别干预处理24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，1.5 h后用酶标仪450 nm波长检测各组细胞的吸光值(OD值)，计算：抑制率=(对照孔吸光值-实验孔吸光值)/对照孔吸光值×100%，绘制细胞生长曲线，共检测3次，取平均值。

2.4 分组处理

将分化好的J774A.1细胞用10%FBS DMEM培养液调细胞密度为5×104mL-1的悬液，使用完全培养液进行培养，待细胞融合至70%左右予以100 mg/L ox-LDL干预处理，24 h后收集细胞，随机分成正常组(10%FBS DMEM完全培养液)、模型组(100 mg/L ox-LDL+10%空白血浆)、TUDCA组(500 mg/L TUDCA+100 mg/L ox-LDL+10%空白血浆)、左归降糖舒心方含药血浆组(100 mg/L ox-LDL+10%左归降糖舒心方含药血浆)、西药联合含药血浆组(100 mg/L ox-LDL+10%西药联合含药血浆)。

2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡

细胞处理结束后，胰酶消化细胞，用无菌PBS清洗1次，将细胞重悬300 μL结合缓冲液，加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL碘化丙啶(PI)染色液混匀，常温避光孵育20 min。另以正常组设未染色管、只加Annexin V-FITC管、只加PI管用于调试及对照，于流式细胞仪进行分析检测。以未染色细胞调零，以Annexin V-FITC单染管和PI单染管作为基准对照，测定细胞凋亡率。实验重复3次。

2.6 Western blot法检测p-PERK、p-eIF2α、ATF4及Caspase-12、CHOP蛋白表达

分别取处于对数生长期的J774A.1细胞,以每孔5×105个接种于6孔板中，细胞培养24 h后加入不同的药物干预，正常组不加药；细胞培养24 h后，弃培养上清液，用PBS洗涤2次，按1∶10的体积比例加入含PMSF的蛋白裂解液，低温下匀浆后将样品转移至1.5 mL离心管中，12 000×g，4 ℃离心10 min，取上清液即为所提取的总蛋白。采用BCA法将蛋白定量后，行SDS-PAVE(分离胶浓度为1 000)分离蛋白。随后将蛋白转移至PVDF膜上，用含5%脱脂牛奶的封闭液室温封闭，加入兔抗人p-PERK、p-eIF2α、ATF4及Caspase-12、CHOP抗体4 ℃孵育过夜，TEST洗涤3次，用化学发光法显影、冲洗胶片。采用Images-Pro Plus 6.0灰度扫描软件对结果进行半定量分析。

2.7 统计学方法

3 结果

3.1 ox-LDL对J774A.1细胞增殖的影响

如表1所示，与正常组比较，J774A.1细胞在不同浓度的ox-LDL干预下，均存在细胞增殖抑制作用，差异具有统计学意义(P<0.01)，且伴随着药物浓度的增加，J774A.1的增殖抑制率呈浓度依赖性改变，其中100 mg/L ox-LDL干预24 h的抑制率为(50.06±0.09)%，故考虑以100 mg/L ox-LDL干预24 h为最佳造模方法。

表1 各组J774A.1细胞增殖情况比较

注：与正常组相比，**P<0.01。

3.2 左归降糖舒心方含药血浆对J774A.1细胞脂质蓄积的影响

油红O染色显示，在ox-LDL诱导下，细胞内脂滴聚集增多，存在浓度依赖性变化，以100 mg/L ox-LDL组增加最为明显(P<0.01)；而浓度在100 mg/L与150 mg/L无明显差异(P>0.05)。正常组油红O染色阳性细胞少或无；各药物干预组平均IOD值与100 mg/L ox-LDL组相比显著下降(P<0.01)，表明左归降糖舒心方含药血浆可显著降低细胞内脂质蓄积；药物干预组间比较，左归降糖舒心方含药血浆组优于西药联合含药血浆组，与TUDCA组相比无明显差异。见图1。

3.3 左归降糖舒心方含药血浆对J774A.1细胞凋亡率比较

如表2所示，与正常组比较，模型组细胞凋亡率显著升高(P<0.01)；与模型组比较，各药物干预组J774A.1细胞凋亡率均明显降低(P<0.01)；与西药联合含药血浆组比较，TUDCA组和左归降糖舒心方含药血浆组J774A.1细胞凋亡率降低较明显(P<0.01)，而左归降糖舒心方含药血浆组与TUDCA组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 各组细胞凋亡率比较

注：与正常组相比，**P<0.01；与模型组相比，##P<0.05；与西药联合含药血浆组相比，△△P<0.01。

3.4 左归降糖舒心方含药血浆对J774A.1细胞PERK/eIF2α/ATF4通路相关蛋白表达的影响

如图2所示，与正常组比较，模型组细胞p-PERK、p-eIF2α、ATF4蛋白表达明显升高，差异具有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，各药物干预组p-PERK、p-eIF2α、ATF4蛋白表达明显降低，差异具有统计学意义(P<0.01)；与西药联合含药血浆组比较，TUDCA组和左归降糖舒心方含药血浆组蛋白表达降低较明显；左归降糖舒心方含药血浆组与TUDCA组之间差异无统计学意义(P>0.05)。

3.5 左归降糖舒心方含药血浆对J774A.1细胞内质网应激介导的凋亡相关蛋白表达的影响

如图3所示，与正常组比较，模型组细胞Caspase-12、CHOP蛋白表达明显升高，差异具有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比较，左归降糖舒心方含药血浆组、西药联合含药血浆组、TUDCA组细胞Caspase-12、CHOP蛋白表达均明显降低(P<0.01)，但各药物干预组仍高于正常组(P<0.01)；与西药联合含药血浆组细胞对比，左归降糖舒心方含药血浆组与TUDCA组细胞蛋白表达更低(P<0.01)，且左归降糖舒心方含药血浆组与TUDCA组具有相同的作用效应(P>0.05)。

4 讨论

糖尿病动脉粥样硬化是糖尿病的主要心血管并发症之一，是2型糖尿病(T2DM)患者致死和致残的主要原因[7]。其早期症状隐匿，中后期因粥样斑块的形成，引起管腔狭窄，易致糖尿病患者心血管终末事件高发[8]。巨噬细胞的泡沫化及凋亡是糖尿病动脉粥样硬化发生发展的重要病理改变[9]。内质网是蛋白质合成、折叠、运输以及储存钙的主要场所，与脂质合成代谢平衡密切相关，对各种刺激极为敏感[10]。在糖尿病动脉粥样硬化过程中，糖脂代谢失常、氧化应激及钙离子失衡等因素，引起错误折叠与未折叠蛋白在腔内聚集以及细胞内钙平衡紊乱的状态。机体代偿过程中，可激活未折叠蛋白反应(UPR)，维持细胞内稳态[11]。而过度或持续的应激状态使机体进入失代偿期，激活ERS反应，诱导巨噬细胞表型转换及胆固醇堆积，相关凋亡信号通路的上调促使细胞凋亡。近年临床与实验研究表明ERS在糖尿病动脉粥样硬化的病理进程中起重要作用，抑制ERS的过度激活成为其潜在的治疗方法[12-13]。

ERS反应中，位于内质网膜上的Ⅰ型跨膜蛋白PERK执行感知和介导反应的功能[14]。在未折叠/错误蛋白蓄积超过UPR的代谢阈值时，PERK与内质网腔中的葡萄糖调节蛋白78(GRP78)出现结构域解离，在磷酸化过程中转化为具有活性作用的p-PERK，进而磷酸化eIF2α，一方面可下调细胞内错误蛋白整体翻译水平，减轻内质网负荷，从而维持细胞生存；另一方面，当ERS进一步加剧时，eIF2α也可特异性活化ATF4表达，激活细胞自噬、抗氧化及蛋白转运等过程，维持稳态[15-16]。随着应激反应的持续，ATF4进入ERS相关凋亡程序，可诱导凋亡相关蛋白CHOP和Caspase-12表达增强。CHOP是特异性的转录因子，过量的表达可促其转位至细胞核，下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达；同时激活三磷酸肌醇受体(IP3R)，促进钙离子释放，进而触发钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶诱导线粒体及ROS等凋亡途径[17]。同时，ERS过程中可特异性激活位于胞浆侧的Caspase-12通路，上调Caspase-9、Caspase-3促发细胞凋亡[18]。CHOP和Caspase-12存在各自的特异凋亡途径或共同协调诱导细胞凋亡，而其凋亡效应的出现受上游PERK/eIF2α/ATF4信号通路的诱导。

在巨噬细胞泡沫化及粥样斑块形成的过程中，ox-LDL发挥重要作用，脂质过氧化可生成多种高反应性醛，造成细胞内脂质堆积诱导成为泡沫细胞，血管壁局部沉积，形成粥样斑块。本实验采用CCK-8法及流式细胞仪检测细胞存活及凋亡率，ox-LDL处理后，J774A.1细胞存活率降低，在100 mg/L的浓度下抑制率是(50.06±0.09)%，细胞凋亡率为(51.07±0.19)%；油红O染色结果表明ox-LDL可成剂量依赖性地引起细胞内脂质增多，与文献报道一致，巨噬细胞泡沫化制备成功[19]。左归降糖舒心方含药血浆可干预有效降低ox-LDL诱导的细胞凋亡，减缓细胞内的脂质堆积。同时，ox-LDL可诱导巨噬细胞清道夫受体表达增加，识别与吞噬效应增强，过度激活ERS，参与细胞炎性反应及凋亡过程。通过检测内质网应激相关凋亡蛋白的表达，结果显示：较正常组，ox-LDL干预诱导的模型组中CHOP、Caspase-12的表达有明显增高的趋势，而左归降糖舒心方含药血浆的干预可有效降低凋亡相关蛋白的表达水平。为了进一步证实左归降糖舒心方含药血浆的保护机制是否与调控内质网应激有关，实验采用内质网应激抑制剂TUDCA作为对照，Western blot结果发现，左归降糖舒心方含药血浆可抑制内质网应激相关信号通路PERK/eIF2α/ATF4的激活，CHOP、Caspase-12的表达，且其作用效果与TUDCA相当，明显优于西药联合含药血浆组。

综上所述，左归降糖舒心方含药血浆对ox-LDL诱导的J774A.1巨噬细胞泡沫化和细胞凋亡有明显的抑制作用。其干预的作用机制可能是通过调控内质网PERK/eIF2α/ATF4信号通路，抑制凋亡关键蛋白CHOP、Caspase-12表达实现的。左归降糖舒心方通过抑制内质网应激介导的细胞凋亡可能是一种干预糖尿病动粥样硬化的新方法，可早期逆转ox-LDL细胞内摄入，截断粥样斑块形成。同时，本研究还需进一步开展体内或临床研究来探索验证左归降糖舒心方对巨噬细胞保护作用及调控糖尿病动脉粥样硬化的机制。