高洪彬，梁十，郭扬清，吴玉娥，贾欢欢，刘婵，李云峰，李航，王希龙，陈梅丽

（省实验动物监测所；广东省实验动物重点实验室，广东 广州）

0 引言

免疫荧光检测技术具有专一性强、灵敏度高、实用性好等优点[1]，目前得到大量应用。但有时由于某些原因，免疫荧光切片未有相应的HE 染色切片可比较分析，即使有HE 切片但由于不为同一组织片、需要观察的位置已经或多或少的发生了改变，不利于与免疫荧光切片进行精准的比较研究。本研究通过实践，探讨了免疫荧光染色后进行HE 染色的方法，并对方法进行了比较分析。

1 材料与方法

1.1 实验动物

[普通级]食物蟹猴3 只，由广东春盛生物科技发展有限公司提供[SCXK（粤）2014-0027]，实验动物及实验方案均得到了动物关怀与使用伦理委员会的批准。动物饲养场所严格按国际实验动物评估及认证管理委员会规定和要求对实验动物进行日常饲养、关怀和管理。

1.2 仪器与试剂

主 要 仪 器：Leica DM3000 正 置 荧 光 显 微 镜，Leica ST5020+SV5030 全自动染色封片一体机，Leica RM2255 全自动轮转切片机，Leica EG1150H+C 石蜡包埋机，Leica TP1020 全自动脱水机。

主要试剂：胰岛素抗原（Gene Tex 公司）、荧光二抗（Invitrogen Life Technologies 公司）PBS 缓冲液（博士德生物工程有限公司）、免疫染色封闭液（碧云天生物技术有限公司）、无水乙醇（广州中南化学有限公司）、95%乙醇（广州凯秀贸易有限公司）、胰蛋白酶（南京建成生物工程研究所）、1%醇溶性伊红（广州凯秀贸易有限公司）、Harris 苏木素（广州凯秀贸易有限公司）、二甲苯（天津市百世化工有限公司）、TO 透明剂（广州市中南化工仪器有限公司）、丙三醇（天津市致远化学试剂有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 组别

选取3 只血糖正常的食蟹猴胰腺蜡块标本，连续切片后多聚赖氨酸防脱玻片捞片，分3 组，每组3 个蜡块，即：空白切片染HE组（A 组），高压修复免疫荧光切片染HE 组（B 组），胰蛋白酶修复染HE 组（C 组）。A 组直接进行HE 染色；B 组使用高压加热修复抗原的方法进行免疫荧光染色，已完成荧光染色的切片进行HE染色。C 组使用胰蛋白酶修复抗原的方法进行免疫荧光染色，已完成荧光染色的切片进行HE 染色。

1.3.2 免疫荧光染色方法

空白切片烤片，二甲苯脱蜡，梯度酒精水化后PBS 冲洗3 次、每次5min，高压加热修（高压锅喷气后5min 停止加热，待自然冷却至室温）或1.25%胰蛋白酶修复（37℃，30min），PBS 冲洗(3 次、每次5min)，荧光封闭液封闭60min，一抗孵育（4℃冰箱过夜），复温（37℃，60min），PBS 冲洗(3 次、每次5min)，二抗孵育（37℃，60min），PBS 冲洗(3 次、每次5min)，晾干，封片。

1.3.3 HE 染色方法

空白切片在二甲苯I 及二甲苯II 中分别浸泡20min 脱蜡梯度酒精脱水至纯水，每个步骤7min。接着进行Harris 苏木素染色10min，再放入水中浸泡1min，1%盐酸乙醇分化5s，流水返蓝15min。转移至90%乙醇浸泡7min，1%醇溶性伊红染色30s，转移至95%乙醇I、95%乙醇II 以及95%乙醇III 各浸泡10s，然后至无水乙醇I、无水乙醇II 脱水各5min，最后在TO 透明剂 I、TO透明剂II 各浸泡7min，封片。

已完成荧光染色的切使用PBS 泡洗（3 次，5min），脱去盖玻片及封片剂后流水冲洗30min。后续进行Harris 苏木素染色等与空白切片相同的程序和步骤。

1.3.4 病理组织学观察

使用显微镜进行组织学观察。B、C 组在染HE 前在荧光显微镜下进行观察和拍照，不同组不同动物的荧光染色和HE 染色切片使用同一光线亮度及照片采集软件参数下进行阅片和拍照。

2 结果

胰腺由外分泌部和内分泌部组成。外分泌部由胰腺腺泡组成，内分泌部由胰岛组成。

A 组3 例组织切片均平整，组织细胞结构清晰，色彩深浅适度，红蓝对比鲜明，着色层次清晰，色调柔和悦目，综合评估染色效果佳。B 组有1 例切片部分组织破损脱落，2 例平整，3 例各指标染色效果与A 组相当，综合评估染色效果佳与A 组相当。C 组3 例组织切片均平整，组织细胞结构清晰，红染偏淡，红蓝对比较鲜明，着色层次较清晰，色调柔和较悦目，综合评估染色效果尚可、但较A、B 组稍差。染色效果见下图①-⑤。

3 讨论

免疫荧光是组织病理学研究的常用实验技术[2]，石蜡切片在进行免疫荧光染色时进行的处理包括有机溶剂脱蜡、梯度酒精水化、PBS 泡洗、抗原修复、荧光封闭液封闭、一抗孵育、二抗孵育及封片等操作[3，4]。组织细胞内嗜酸性成分结合伊红显示红色、嗜碱性物质结合苏木素显示蓝色[5]，由于整个实验过程未接触强酸强碱性等可改变组织成分酸碱度的溶剂，而PBS 溶液的使用能够对可能的组织细胞成分酸碱度的改变起到缓冲调节作用，因而理论上进行了免疫荧光染色的切片可以进行HE 染色且显色正常。免疫荧光切片的封片剂常使用有抗荧光淬灭作用的丙三醇PBS 溶液[6]，由于丙三醇溶于水[6]，故使用PBS 溶液浸泡除去盖玻片、流水冲洗去除组织上残留的封片剂。

本实验观察到免疫荧光切片，按常规HE 染色的方法和程序进行染色即可得到较理想效果。B 组有的切片可见组织破碎、脱落，该切片在进行HE 染色之前已经是有相应的区域破碎、脱落，组织块的破损主要是发生在进行免疫荧光染色抗原的高压热修复过程[7]。进行HE 染色前组织平整的切片，进行HE 染色后未发现脱落现象。实验发现高压修复免疫荧光切片续染HE 组的染色效果理想，染色效果和空白组织切片直接进行HE 染色的效果相当。C 组HE 染色效果尚可，可以进行组织病理学观察，但染色效果较差，主要表现为伊红染色效果较差，这可能是在进行免疫荧光时使用胰酶对抗原进行修复的同时组织细胞的其它蛋白质成分也被或多或少的消化[8]，由于蛋白质嗜伊红，所以HE 染色效果体现出伊红染色的不足。

图1