谷诗浓，刘毓佳，王振杰，黄赛娥

（1.福建中医药药大学,福建 福州;2.福建省康复技术重点实验室,福建 福州;3.福建中医药大学附属康复医院,福建 福州）

0 引言

脑卒中是临床疾病中一种常见的急危重症，绝大部分脑卒中病例是由短暂性或永久性脑血管闭塞引起的局灶缺血性脑血管病[1]。是世界公认第三大致死性疾病，临床上具有高发病率、高致残率及高死亡率的特征，给社会和家庭带来沉重负担[2]，是属于中医学“中风病”范畴。

近几年研究表明，细胞自噬是细胞内的基质和细胞器通过溶酶体系统进行降解的过程，它是促进细胞在各种压力环境下存活的重要功能。自噬在脑缺血损伤中起着重要作用，它带来的影响是具有两面性的，与多种蛋白通路相关，也受复杂的因素调节[3-4]。随着对细胞自噬的不断了解，自噬的生物学作用与修复损伤神经元功能方面的联系逐渐显现出来，可在再灌注损伤早期利用溶酶体清除受损细胞器，发挥保护作用[5-6]。针刺在临床治疗和康复治疗脑卒中疾病中广泛使用，能有效改善损伤，提高患者生存质量[7-9]。百会穴是调节大脑功能的要穴，百脉之会，贯达全身。头为诸阳之会，百脉之宗，而百会为各经脉气会聚之处。穴性属阳，又于阳中寓阴，故能通达阴阳脉络，连贯周身经穴，对于调节机体的阴阳平衡起着重要的作用。故本研究选以电针百会穴为干预手段，通过观察神经功能行为学评分，探讨电针百会穴是否通过调节自噬蛋白P62，从而对缺血再灌注损伤大鼠神经功能起到保护作用。

1 实验材料与方法

1.1 实验动物

60 只 清 洁 级 健 康 雄 性SD 大 鼠，体 质 量 为（250±20）g，由上海斯莱克实验动物责任有限公司（许可证号：SCXK（沪）2012-003）提供，在福建中医药大学实验动物中心（许可证号：SYXK（闽）2013-005）分笼饲养，温度适宜，并进行适应性喂养5天，日夜12h 循环光照系统，给予自由饮食、饮水，并对大鼠进行编号。当大鼠体重为（280±10）g 进行模型制作和电针干预。

1.2 主要试剂及仪器

线栓（广州佳灵生物技术有限公司）；水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司）；G6805-Ⅱ型电针治疗仪(上海华谊公司)；P62抗体（Cell Singaling Technology 公司）；PMSF、BCA 蛋白定量试剂盒、电泳胶配液、超敏ECL 发光试剂盒（博士德生物有限公司）。

1.3 实验动物分组与模型制作

将60 只 体 质 量 为（250±20）g 的SD 大 鼠 通 过 随 机 数字表法分为四组，分别为空白组、假手术组、模型组、电针组，每 组15 只。大 鼠 饲 养 至 体 重 为（280±10）g 时 开 始 造模，术前一天禁食不禁水12h。称重后，按照3.3mL/1kg 进行腹腔注射10%的水合氯醛麻醉。麻醉成功后以仰卧位固定于手术台，酒精消毒备皮，沿颈部正中缺口剪开3-5cm切口，钝性分离并充分暴露出颈总动脉( common carotid artery,CCA)、颈 外 动 脉( external carotid arter,ECA)、颈 内 动脉( internal carotid artery,ICA)。假手术组只进行血管分离后缝合并不插入线栓，模型组与电针组参照Longa 法[10]并加以改良。游离ECA 主干,结扎远心端并将其离断。在ECA 残端用眼科剪剪开一“V”型小口,剪口之前用微动脉夹夹闭CCA 和ICA。将线栓小心地从切口插入。去除ICA 上的动脉夹，让线栓进入，以遇到轻微阻力为准，进入深度约为18-20mm。线栓成功进入后，阻塞左侧大脑中动脉开口，缝合前观察2-5min 无渗血出血情况后可进行缝合。阻塞2h 后，将线栓缓慢抽出线栓至颈总动脉分叉处。麻醉期间注意保温直至动物苏醒。手术结束待动物苏醒2h 后参照Zea Longa 神经行为学评分标准，对实验老鼠进行评分判断手术是否成功。0 分：提起鼠尾，可伸展双上肢，无神经缺损症状；1 分：不能完全伸展对侧前爪；2 分：提起鼠尾对侧前肢内旋，肩内收，行走时向对侧转圈；3 分：行走时向对侧倾倒；4 分：不能自发行走，意识丧失。神经功能评分为1-3 分的大鼠视为造模成功，纳入实验，0分和4 分者剔除。

1.4 选穴及干预方法

待造模成功后，将大鼠固定至鼠板上进行适应性训练，从第二天开始对电针组进行电针干预，空白组、假手术组和模型组每日同等条件抓取不进行干预。腧穴定位参考《实验针灸学》[11]，“百会”位于顶骨正中，两耳尖连线中点，使用0.5 寸华佗牌针灸针，向前斜刺2 mm。进针2-5mm，选择疏密波，频率1/20Hz，电流强度1-3mA，30min/次，1 次/天。选择每天上午固定时段进行电针，干预7 天后将实验动物处死、取材。

1.5 神经行为学评分

造模成功后，参照Zea Longa 神经行为学评分标准：0 分为神经功能无障碍；1 分为提尾时向对侧前肢屈曲；2 分为不能直行，大鼠向左侧旋转；3 分为行走困难，行走时向对侧倾倒；4 分为严重意识障碍，无自发活动或意识不清。电针组连续干预7 天，每次针刺结束2h 后评分、记录，其余3 组同等条件抓取，不进行干预，记录评分。

1.6 蛋白免疫印迹（WesternBlot）

7 天电针干预后，每组随机取出5 只大鼠，腹腔麻醉，迅速断头取脑，分离取出大鼠缺血半暗带组织，放于-80℃冰箱保存。对组织称重，加入裂解液，BCA 法检测样本蛋白浓度。将计算好的上样量加入12%的分离胶和浓缩胶中电泳分离，将分离后的蛋白转至PVDF 膜上，5%脱奶粉封闭1h。封闭后放入一抗4℃过夜，TBST 洗3×5min，放入二抗室温摇床孵育1h。TBST 洗3×5min，按照A 液：B 液=1 ∶1 的比例配置ECL 显影液，将PVDF 膜充分浸入显影液后放入凝胶成像仪器内显影。实验重复3 次，用Image J 软件进行灰度值分析。

1.7 统计学分析

所有实验数据均采用SPSS 22.0 统计软件处理，以均数±标准差（）表示，各组数据比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用 LSD 法（方差齐）或 Dunnett’s T3 法（方差不齐），以P ≤0.05 为差异有统计学意义的标准。

2 结果

2.1 各组大鼠神经行为学评分比较

模型制备后，模型组与电针组相比较于假手术组和空白组均有神经功能缺损表现（P＜0.05）。干预7d 后，模型组损伤比较严重，电针组损伤评分明显降低（P＜0.05），表明电针对缺血再灌注大鼠神经功能损伤有改善意义（见表1）。

表1 各组大鼠Zea-Longa 神经功能行为学评分比较，

表1 各组大鼠Zea-Longa 神经功能行为学评分比较，

组别 n 缺血再灌注2h 缺血再灌注7d空白组 15 0 0假手术组 15 0 0模型组 15 2.13±0.67 2.38±0.78电针组 15 2.17±0.70 1.57±0.65

2.2 各组大鼠P62 蛋白表达比较

P62 的灰度值的计算以β-actin 为内参，与空白组和假手术组比较，模型组P62 表达增多。7d 干预后，电针组与模型组相比较P62 表达降低（P＜0.05）（见图1、图2）。

图1 Western blot 法检测各组大鼠缺血半暗带皮层Beclin-1 蛋白的表达

图2 各组大鼠缺血半暗带皮层Beclin-1 蛋白的表达水平比较

3 讨论

近年随着人民生活方式转变和人口老龄化加剧，缺血性脑卒中的发病率逐年升高并呈年轻化趋势，缺血性脑卒中更是十分重大的公共卫生问题，严重加重了全球疾病负担。是世界范围内的第三大死因(仅次于冠心病和癌症)，其中87%发生在低收入和中等收入国家[12]，为更患者寻找简易价廉的医疗手段用于防治缺血性脑卒中疾病的需求迫在眉睫，而祖国医学迄今为止在防治心脑血管疾病中仍发挥着至关重要的作用，临床上针刺的疗效有目共睹，因此本研究选取传统针刺作为干预手段。同时研究表明电针可通过调节神经通路、炎症反应、蛋白表达、细胞凋亡等多方面改善缺血再灌注大鼠的神经功能损伤[13-16]，但具体机制并不明确。对于缺血性中风的研究，仍然有必要从多角度、多靶点寻找治疗手段。

自噬在缺血再灌注损伤中的作用是一种高度保守的自我清除与降解的动态平衡过程。当机体受到各种损害导致细胞器受损时，会激活自噬以降解受损细胞器和清除蛋白质[17]。在缺血再灌注损伤中，成熟的自噬体通过Ras 相关蛋白7(Rab)与溶酶体融合形成自噬溶酶体，并最终在自噬底物蛋白P62/(sequestosomel,SQSTM1)的参与下被降解。微管相关蛋白1 轻链3（microtubuleassociatedprotein 1 light chain3,LC3)参与自噬体的形成，并在自噬体的降解中发挥辅助作用，P62 参与自噬的降解，故P62 蛋白与自噬密切相关。可以通过观察P62 的变化来评估自噬的形成，了解受损组织内的自噬情况[18-19]。本研究在缺血再灌注损伤后发现P62 含量明显下降，而在电针干预后，电针组与模型组比较神经行为学评分表明大鼠损伤有效改善，P62 含量上升。表明P62 蛋白可能参与了神经功能的保护机制，为临床治疗提供更多可能的靶点，对于临床合理推广针刺治疗缺血性卒中具有重要意义。