丁晓燕 柯志意 朱秀云 郑海霞 袁静 潘延超 张明霞

2019年12月，在中国武汉市爆发了由新型冠状病毒（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2，SARS-CoV-2，此前称2019-nCoV）引起的肺炎疫情，随后在全中国乃至全世界引起流行。2019-nCoV 传染性强，主要经过呼吸道飞沫传播或者接触传播[1]，短期内造成了大量人群的感染，严重危害了人类健康。

当前新型冠状病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）的确诊一般需要结合流行病学、临床表现和病原学证据，并且目前病毒病原学检测对新型冠状病毒肺炎的诊断起决定性作用。病毒病原学检测主要针对病毒的核酸进行检测分析，现2019-nCoV 的核酸检测主要有两种方法[2]，一种是对患者呼吸道、血液或粪便等标本中病毒颗粒的核酸进行实时荧光定量聚合酶链式反应（Quantitative Real-time PCR，qPCR）分析；另一种是进行基因测序，由于基因测序耗时长，成本较高，所以对病毒核酸进行qPCR 是当前阶段的主要检测方法。核酸检测具有早期、敏感、特异性高、易操作等优势[3]，但是对于核酸检测结果的准确性还需要考虑样本类型、样本质量、实验因素、试剂盒性能和患者病程等方面，所以在以病毒核酸检测阳性是新型冠状病毒肺炎诊断金标准的情况下，试剂盒的准确性和灵敏性凸显其重要性。

本研究对深圳市定点收治医院（深圳市第三人民医院）2020年2月9日到2月11日期间用两种国产核酸检测试剂盒检测的101 份样本结果进行了对比，评价不同试剂盒检测性能有无差异，从而发现和提出目前2019-nCoV 核酸检测试剂盒需要改进之处，提高临床检测的准确性。

1 资料与方法

1.1 临床资料与试剂

1.1.1 临床资料

经医院伦理委员会批准同意（批件号[2020-061]号），采集2020年2月9日和2月11日期间深圳市第三人民医院疑似和确诊的新型冠状病毒肺炎患者的鼻咽拭子和痰液，共101例，其中男性48例，女性53例，平均年龄（42.02±19.25）岁，提取核酸进行检测。

1.1.2 主要试剂与仪器

本研究中所有样本核酸提取采用磁珠法RNA提取试剂盒及其配套的核酸纯化仪（杭州博日科技有限公司），q-PCR 系统均为ABI 7500（美国Thermo Fisher）；选取2个不同企业生产的试剂盒，分为A、B 两个实验组，其中A组试剂[A 试剂购自达安基因，新型冠状病毒2019-nCoV 核酸检测试剂盒（荧光PCR法），批号：2020007为本院在用的临床诊断COVID-19 的实验室参考试剂，即本院判断临床样本结果以A 试剂结果为参考]。B组试剂[B 试剂购自泰乐德，新型冠状病毒（2019-nCoV）核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针），批号：20200102]。

1.2 方法

1.2.1 检测方法

实验及相关医护人员均严格按照《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》（卫办医政发[2010]194 号）[4]、《国家卫生健康委办公厅关于印发新型冠状病毒实验室生物安全指南（第二版）的通知》（国卫办科教函[2020]70 号）[5]及《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南（第二版）》[6]等相关文件进行实验操作和生物安全防护。

每份样本同时使用A组和B组试剂进行平行检测，操作过程严格按照说明书进行。核酸扩增：使用ABI 7500 PCR 仪根据不同厂家试剂说明书设置反应程序、扩增检测并对结果进行阴性、阳性判定。质量控制：每批实验均带阴性和阳性对照，阴性和阳性对照检测结果在控，则该批次实验有效，反之无效。

1.2.2 数据处理

采用GraphPad Prism 7.00 软件进行数据分析。计数资料用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种试剂的基本情况的比较

两种核酸检测试剂盒均使用PCR-荧光探针法，且均为双靶标检测，检测基因类型均为ORF1a/b和N 基因。其中试剂A 包含内源性检测系统（内标基因探针采用Cy5 标记），其检测灵敏度为500 copies/mL；而试剂B 检测灵敏度为3 000 copies/mL。两种试剂盒体系配制、RNA 上样量、荧光检测和扩增程序及结果判读方面稍有差异。本研究采用的标本类型包括鼻拭子、咽拭子和痰液，均包含在这两种试剂盒用途范围内。见表1。

2.2 两种试剂检测结果比较

根据试剂盒说明书，将本次实验结果无法判断阴阳性记为可疑，即A组中仅有单一通道≤40的样本记为可疑；B组中单一通道＜38 或者两个通道Ct 值均在38 到45 之间的记为可疑。试剂A 阳性率为31.68%，阴性率为55.45%；B 试剂阳性率为34.65%，阴性率为52.48%。差异无统计学意义（P＜0.05），见表2 及图1。

表1 两种试剂基本情况比较Table1 Compare the basic case of the two reagents

表2 两种试剂检测结果比较Table2 The result of the 2 reagents

图1 两种试剂检测结果图Figure1 The test results of the two reagents

2.3 两种试剂盒对两个基因的检测效果比较

为分析试剂盒对检测位点ORF1a/b基因和N 基因的检测效果，分别对检测的101例样本进行了单个基因的检出结果统计，根据各试剂盒说明书，将无法判断阴阳的记为无效，即将A组中检测出Ct 值但是Ct 值大于或等于40 记为无效；将B组中Ct 值范围在38～45（包括端点值）之间的记为无效。分析发现，A、B 两种试剂盒对N 片段检出率均大于对ORF1a/b的检出率见表3。

表3 两种试剂单通道检测率分析[n（%）]Table3 Single-channel detection rate analysis of 2 reage[n（%）]

2.4 两种试剂检测结果的相关性分析

为比较两种试剂盒检出Ct 值的相关性，本研究在101例样本选取其中符合《国家卫生健康委办公厅关于印发新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第六版）的通知》（国卫办医函〔2020〕145 号）[7]相关标准的14例临床确诊为COVID-19 患者样本，比较其qPCR Ct 值，随后进行相关性分析。可知在确诊患者的检测结果中A 试剂盒的Ct 值在ORF1a/b位点的数值较B 试剂盒偏高，而在N位点两种试剂盒检测结果非常相近。见表4和图2。

3 讨论

新型冠状病毒是属于网巢病毒目（Nidovirales）下的冠状病毒科（Coronaviridae），病毒颗粒由基因组和结构蛋白组成，其基因组是线性单股正链RNA[8]，包含7～14个开放阅读框（Open reading frame，ORFs），从5'端开始，基因1 包含基因组的三分之二，长度为20～22 kb，由两个重叠的开放阅读框1a和1b组成，共同起着病毒RNA 聚合酶（Pol）的作用。而结构蛋白一般有3种：核衣壳（Nucleocapsid，N）蛋白、突刺（Spike，S）蛋白、跨膜（Membrane，M）蛋白[9]。

表4 两种试剂盒对14例阳性样本检测Ct 值Table4 Ct values of 14 positive samples

图2 两种试剂检测14例阳性样本检测结果图Figure2 The results of 14 positive samples tested by 2 reagents

qPCR检测新型冠状病毒核酸阳性是新冠肺炎诊断的金标准，该方法是将2019-nCoV 的全基因组RNA 序列上高度保守的序列片段作为目标序列，现行的2019-nCoV 核酸检测基本都是采用该病毒的开放阅读框1a/b和核衣壳蛋白基因区域为检测位点[8]。本实验中使用的两种试剂盒的靶点也是2019-nCoV 的ORF1a/b位点和N位点，同时检测两种靶标，可以提高临床诊断效率。

本研究用两种国产试剂对101例样本进行了检测，结果显示本研究现使用的试剂盒性能相近，但是其具体效果如何仍需要继续分析，并且两个试剂盒的可疑率均为12.87%，因为在实验室检查中对可疑的样本需要进行复测，在面对大量样本时这无疑会加大检验人员的工作量，所以如何降低可疑率也是值得探讨的问题。

统计101例样本中，试剂A和试剂B 各自的单通道检测结果，发现两种试剂对N 片段的检出率均大于ORF1a/b片段的检出率，推测两种试剂盒中N 片段的敏感性较ORF1a/b片段灵敏，一般而言，敏感性与特异性呈负相关，所以本实验中两种试剂盒的N 片段特异性较ORF1a/b片段低，但是是否当前2019 nCoV 检测试剂盒中N 片段特异性都较ORF1a/b片段低，还需要进行深入分析。

本研究在101例样本中选出14例确诊病人的结果进行两种试剂盒检出的Ct 值进行相关性分析，发现两种试剂盒对于两个通道的结果相关性较强，对于ORF1a/b位点试剂A 检出的Ct 值较试剂B高，而对于N位点的检出结果非常相近，推测两种试剂盒N 片段的检测性能较ORF1a/b更接近。