申圣圣 杨利艳 乔美玉 王昭清 王创云

摘 要： 以鱼腥草为材料，以日光灯处理为对照，分析了不同光质LED光源（白、红、黄、绿、蓝LED灯）对鱼腥草叶片活性氧、类黄酮含量及抗氧化酶的影响。结果表明，蓝光下叶片中TBARS（硫代巴比妥酸）含量最高，较对照高30.18%，与希夫试剂染色结果相一致;过氧化氢产生最多，较对照高190.21%，与DAB染色结果一致;超氧阴离子产生速率在蓝光下最高，为对照组的1.54倍，白光下最低;蓝、绿光下脯氨酸含量是对照的2倍;蓝光和黄光处理下，黄酮含量较对照提高了21.4%。蓝、绿光提高了SOD2同工酶的表达，且在蓝光下最高;蓝、绿、红、黄光处理分别诱导了更多的POD基因位点的表达;不同LED光质均提高了CAT抗氧化酶活性，其中蓝、绿光下CAT同工酶的表达量明显高于对照。综上所述，蓝色光处理可以有效提高幼苗的抗氧化能力，可为鱼腥草品质的控制提供参考。

关键词： 鱼腥草; LED; 活性氧; 抗氧化; 黄酮

中图分类号： S636.9   文献标志码： A   文章编号：1673-2871（2020）04-017-06

Abstract： In this study， Houttuynia cordata Thunb. was used as plant material， and the group with fluorescent lamp treatment was the control group. The effects of LED light with different light quality （white， red， yellow， green and blue LED lights） on reactive oxygen species， flavonoids content and antioxidant enzymes of Houttuynia cordata Thunb. leaves were analyzed. The results showed that under blue light， the TBARS content was the highest， 30.18% higher than the control group， which was consistent with Schiff reagent staining results. And hydrogen peroxide produced the most， 190.21% higher than the control group， which agreed with DAB staining. The superoxide anion production rate was the highest under blue light which was 1.54-fold compared with the control group， and it was the lowest under white light treatment. Proline content was 2-fold to the control group. The content of flavonoids increased by 21.4% in blue and yellow light treatments compared with the control group. Blue and green light enhanced the expression of SOD2 isoenzyme， and it was the highest under blue LED. Blue， green， red and yellow LED induced more POD gene loci expression， respectively. The various LED monochromatic light improved the CAT activity， within them， CAT activity in blue and green light treatment was obviously improved. In conclusion， blue light treatment can effectively improve the antioxidant capacity of seedlings.

Key words： Houttuynia cordata Thunb.; LED; Reactive oxygen species; Antioxidant

魚腥草（Houttuynia cordata Thunb.）又名折耳根，为多年生草本，全株有腥臭味，常呈紫红色[1]。作为我国的传统中药植物，鱼腥草不仅具有抗菌、抗病毒等药用价值，同时富含大量的碳水化合物、膳食纤维、氨基酸和一些生命活动必需的矿质元素，是中国卫生部评定的药食两用植物[2]。近年来，随着人们物质生活水平和保健意识的提高，可食用植物的保健价值受到越来越多的关注，天然抗氧化物质成为大众关注的热点。

光照是植物生长发育过程中的重要环境因子，它不仅是植物进行光合作用的能量来源，而且还作为环境信号对植物的代谢起调控作用[3-4]。20世纪50年代，试验证实了光质的存在并发现其调控植物的生长。大量研究表明，光质对植物的光形态建成、光合特性、内源激素、生物产量以及抗氧化系统都有影响[5]。由于植物识别光质的受体不同，因此不同光质对植物发育及代谢的影响不尽相同[6]。光质的变化会引起植物代谢的相应改变，发光二极管（LED）作为新型半导体固态冷光源，具有发光效率高、发热低、体积小、能耗低、寿命长等优点，能提供植物生长所需的特定光谱[7-8]。对LED单色光谱的光源进行组合能提高光合作用效率，节约能源[9]。目前LED光源已应用于植物组织培养、设施园艺、蔬菜栽培、温室补光、种苗生产和芽苗菜培养等领域。有研究表明，单色LED红光、蓝光处理能够提高植物抗氧化酶POD、SOD和CAT的活性，而绿光则有抑制作用[10]。不同光质处理如何影响鱼腥草活性氧的产生，如何利用LED光源提高其抗氧化能力值得进一步研究。

笔者以不同光质LED光源培养鱼腥草，通过组织化学染色对其在代谢过程中产生的一系列活性氧如TBARS（硫代巴比妥酸）、H2O2（过氧化氢）、O2-·（超氧阴离子）进行了测定，并分析了不同光质LED下黄酮的积累及抗氧化酶活性，以期为利用LED灯提高鱼腥草抗氧化能力提供基础研究。

1 材料与方法

1.1 材料

采用优质鱼腥草（购自湖北宜昌）根茎进行繁殖。

1.2 方法

试验于2017年4月12日至8月20日在山西临汾，山西师范大学3号楼生物工程实验室内进行。将新鲜鱼腥草根茎放在盛有适量自来水的塑料水培槽中，置于光照培养箱中进行培养，温度25 ℃/20 ℃，光照周期昼/夜（8 h/16 h），每3 d换水1次，待鱼腥草根茎上的幼芽完全展开后，将长势较好的鱼腥草移栽到盛有25% Hoagland营养液的水培槽中按原条件培养。待第3片叶子完全展开后，移到温室用不同光质的LED光源处理（表1），3周以后取材测定。

1.3 生理指标测定

1.3.1 TBARS含量的测定及脂质过氧化染色显示  以TBARS含量表示脂质过氧化。用0.1%（w）三氯乙酸溶液冰浴研磨提取，取上清，加入0.5%TBA（溶解于20%三氯乙酸），依次在450、532、600 nm测定吸光值[11]，计算TBARS含量：TBARS含量（μmol·g-1）=6.45（OD532-OD600）-0.56×OD450。脂质过氧化程度根据希夫试剂染色法测定，染色后拍照[12]。

1.3.2 过氧化氢含量的测定及组织化学染色 用硫酸钛比色法测定过氧化氢含量，测定波长412 nm的吸光度。以吸光度值为纵坐标，过氧化氢物质的量（nmol）为横坐标，制作标准曲线并分析结果。用DAB染色法显示过氧化氢含量[13-14]。

1.3.3 超氧阴离子的产生速率测定 用羟胺法测定超氧阴离子产生速率[15]，530 nm处测定吸光度。超氧阴离子产生速率（nmol·min-1·g-1）=（n×V×1 000）/（Vs×t×m）。式中：n是由标准曲线所查的溶液中的超氧阴离子的物质的量（μmol）;V是样品提取液总体积（mL）;Vs是测定时取样液体积（mL）;t是样品与羟胺反应的时间（min）;m是样品鲜质量（g）。

采用NBT方法测定超氧阴离子含量：将鱼腥草浸泡于0.1%的NBT染色，在乙醇中脱色后拍照[16]。

1.3.4 脯氨酸（Pro）含量的测定 用磺基水杨酸比色法测定[17]。脯氨酸含量（mg·g-1）=（C×V）/（W×Vs×103）。式中：C是根据回归方程计算的脯氨酸含量（μg·mL）;V是提取液总体积（mL）;Vs是测定时取用样液的体积（mL）;W是样品干质量（g）。

1.3.5 黄酮类化合物的测定 黄酮类化合物的提取以乙醇为溶剂，采用索氏回流法提取[18]，以芦丁为标品绘制标准曲线测定黄酮类物质的含量。黄酮含量（μg·mL-1）=C×V×10-6式中：C是从标准曲线查得的黄酮浓度（μg·mL-1）;V是提取的浓缩液体积（mL）;10-6是将μg·mL-1换算的系数。

1.3.6 同工酶电泳分析 称取各处理组0.2 g鱼腥草叶片，弃叶脉，制备粗酶液，离心、取上清与等体积上样缓冲液，进行PAGE同工酶凝胶电泳，然后将凝胶置于盛有显色液的培养皿中，于摇床上显色观察。

超氧化物歧化酶同工酶（SOD）染色采用氮蓝四唑（NBT）光还原法;过氧化物酶（POD）同工酶采用联苯胺染色法;过氧化氢酶（CAT）同工酶采用 FeCl3染色法[19-21]。

2 结果与分析

2.1 不同光质的LED光源对TBARS含量的影响

不同光质的LED光源培养条件下，鱼腥草叶片TBARS含量变化如图所示（图1-a）。与对照组相比，在LED蓝光、绿光、白光下，TBARS含量均有提高，分别提高了26.2%、13.0%、9.8%;在黄光、红光下，TBARS含量分别降低了20.2%、8.2%;蓝光下TBARS含量最高，表明LED蓝光下叶片膜脂受到伤害最大。

在不同光质的LED下，鱼腥草叶片希夫试剂的染色结果如图所示（图1-b），颜色深浅反应了膜脂的过氧化程度。其颜色变化由深到浅如下：蓝光、绿光、白光、对照组、红光、黄光，与TBARS测定结果一致。

2.2 不同光质的LED光源对过氧化氢含量的影响

在不同光质的LED培养下，鱼腥草叶片过氧化氢含量变化如图所示（图2-a），与对照组相比，除红光组外，其他光质处理极显著地提高了过氧化氢的含量。红光组、黄光组、绿光组、白光组和蓝光组分别提高了6.6%、40.6%、75.8%、86.9%、170.0%，结果表明，不同光质的LED光源普遍使过氧化氢含量增加，用蓝光处理时含量的变化最显著。

DBA能和过氧化氢反应生成深褐色的聚合物，叶片颜色的深浅反应了过氧化氢的积累量。本試验中，对照组中生成的聚合物颜色最浅，蓝光照射下叶片的染色最深，与测定结果一致（图2-b）。

2.3 不同光质的LED光源对鱼腥草超氧阴离子生成速率及含量的影响

不同光质LED对鱼腥草叶片超氧阴离子产生速率不同（图3-a）。与对照组相比，蓝光和黄光显著提高了超氧阴离子的产生速率，分别提高了49.00%、38.18%;白光和绿光处理下超氧阴离子产生速率显著降低。即超氧阴离子在LED蓝光下产生速率最高，白光下最小。鱼腥草叶片中NBT染色如图（图3-b）。LED蓝光下叶片的染色最深，白光下叶片染色最浅，组织化学染色与试验数据结果一致。

2.4 不同光质的LED光源对鱼腥草叶片脯氨酸含量的影响

在不同光质的LED培养下，鱼腥草叶片脯氨酸含量变化如图所示（图4），与对照组相比，不同光质的LED光源均显著提高了鱼腥草叶片中脯氨酸的含量，其中蓝光与绿光组的脯氨酸含量最高，两组间差异不显著;红光与白光组的脯氨酸含量差异不显著，低于蓝光、绿光组;黄光组与其他各组之间存在明显的差异。蓝光、绿光下脯氨酸的含量较其他光质处理高。

2.5 不同光质的LED光源对鱼腥草叶片黄酮含量的影响

在不同光质的LED灯下 ，鱼腥草叶片中的黄酮类化合物含量变化如图5，不同波长的LED光均显著提高了黄酮类物质的含量，红、黄、绿、蓝光组分别较对照提高了15%、22%、20%、22%，但这4组的黄酮类含量差异不显著;LED白光组的黄酮类化合物含量较对照组变化也显著。可以看出，蓝光、黄光最大程度地提高了叶片中黄酮含量，绿光次之，说明LED光源能够促进鱼腥草黄酮类化合物的合成，且单色光源有显著的促进作用。

2.6 对鱼腥草叶片SOD同工酶的影响

SOD是生物体内重要的抗氧化酶，是清除自由基的首要物质，与体内的CAT和POD一起组成一条完整的防氧化链条，完成对超氧自由基的清除。在不同光质的LED灯下 ，鱼腥草叶片中的SOD同工酶表达量变化如图6、表2，结果显示，蓝色、绿色波长的LED光显著提高了SOD1、SOD2同工酶的表达量，且在蓝光下的表达量为最高，黄光抑制了SOD1、SOD2的表达量，但最大程度激发了SOD3的表达。说明蓝色LED光对清除鱼腥草超氧自由基起到积极作用。

2.7 对鱼腥草叶片POD同工酶的影响

在不同光质的LED灯下，鱼腥草叶片中的POD同工酶表达量变化如图7、表3，POD是对环境变化非常敏感的氧化酶。本试验结果发现，红、黄、绿、蓝光处理分别诱导了更多的POD基因位点表达，其中，绿光诱导了POD3、POD4和POD7 3条谱带;红光、蓝光则诱导了POD3、POD7;白光处理与对照组POD基因的表达一致。比较各谱带的IOD可知：POD1、POD2、POD5和POD6的表达量在大多LED单色光处理下均高于对照组。说明LED光源能够促进鱼腥草对POD同工酶的表达，且多数情况下单色光源有显著的促进作用。

2.8 对鱼腥草CAT同工酶的影响

在不同光质的LED灯下，鱼腥草叶片中的CAT同工酶表达量变化如图8、表4，经多次不同的凝胶染色方法对CAT同工酶染色确定，鱼腥草的CAT同工酶仅有一条酶带。不同光质影响了CAT的表达量，但并没有诱导更多的CAT基因位点表达。对IOD分析表明CAT的表达量依次为绿光>白光>蓝光>红光>黄光>对照，即以上光质均提高了CAT的表达。表明单色LED光源对CAT同工酶含量的表达具有促进作用。

3 讨论与结论

植物生长受诸多环境因子的影响，逆境会造成植物的膜脂产生过氧化损伤。TBARS是膜脂过氧化的产物，可以作为膜脂过氧化程度的指标，本试验结果表明，蓝光对膜脂的伤害最大，绿光次之，与短波能量高相一致，也与胡陽的研究结果相一致（REF）[22]。当植物所受胁迫超过其自身调节能力时，植物体内活性氧（ROS）的代谢平衡遭到破坏，过量的活性氧会引发膜脂的过氧化从而使生物膜系统遭到破坏，造成细胞结构和功能受损甚至导致植物体死亡。测定组织中自由基的活跃状态，可间接了解组织受损状况以及抗性强弱。本试验结果表明，蓝光下鱼腥草叶片O2-·产生速率最快，含量最多，与卢素萍[23]的研究结果一致，且各LED处理下植物组织中的过氧化氢含量都高于对照组。

抗氧化系统是植物重要的防御系统，包括抗氧化酶和一些分子如脯氨酸。在生物体内，脯氨酸不仅仅是理想的渗透调节物质，而且还可作为膜和酶的保护物质及自由基清除剂[24]。笔者研究发现，绿光和蓝光处理组中脯氨酸含量最高，由于短波能量高对膜的氧化损伤加剧，所以植物通过积累更多的脯氨酸来降低对膜的损伤，这是植物的自我防御响应[25]。但王莉荣等[26]研究表明，红光处理提高了葡萄试管苗中游离脯氨酸含量，可能与不同物种或处理强度不同有关。

张寒等[27]研究表明，单色LED红光、蓝光处理能够提高鱼腥草抗氧化酶POD、SOD和CAT的活性，而绿光则有抑制作用，本试验结果表明，不同氧化酶对不同光质的响应不同，其中POD的响应更为敏感，绿光、蓝光和红光诱导了新的基因位点的表达并提高了酶活，不同光质不能诱导SOD和CAT新的基因位点的表达，但可以提高其活性，均为绿光下活性最高，与郝俊江等[28]的研究结果一致。

黄酮类化合物广泛存在于自然界某些植物和浆果中，是一种很强的抗氧剂，可有效清除体内氧自由基，其阻止氧化的能力是维生素E的10倍以上，这种抗氧化作用可以延缓细胞衰老和退化，并抑制癌症的发生[29]。同时，黄酮类物质可以改善血液循环，降低胆固醇含量，促进伤口愈合，对胶原蛋白起稳定作用。笔者发现，通过蓝、黄LED光照处理可以增加叶片中黄酮的积累，说明适宜的高能量光可以促进鱼腥草抗氧化物质的积累，与徐琳煜[30]的研究结果一致。因此，设施栽培中可以根据不同需求设置不同光照条件，以提高天然生物活性物质的含量，从而利于中药材品质控制及可持续利用。

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