高文静1,2,逄 高3,郭莹莹2,*,王联珠2,*,江艳华2,刘占涛

(1.中国海洋大学食品科学与工程学院,山东青岛 266003; 2.中国水产科学研究院黄海水产研究所,山东青岛 266071; 3.大连工业大学食品学院,辽宁大连 116034; 4.青岛大学医学院,山东青岛 266021)

铅(Lead,Pb)是一种普遍存在的环境污染物,因其具有非生物降解性,可在环境和生物系统中持久存在和不断蓄积[1]。铅主要通过消化道和呼吸道进入体内并长期储存,损伤中枢神经系统,造血系统、肝脏和肾脏等,造成机体功能障碍[2]。目前,铅中毒治疗方式主要是利用螯合剂来促进体内铅排出,临床上常用的螯合剂如二巯基丁二酸(dimercaptosuccinic acid,DMSA)、依地酸(disodium edetate,EDTA)、青霉胺(penicillamine,DPA)等[3],研究发现螯合剂在排铅的同时,其他人体必需元素也随之排出[4]。此外,螯合剂主要用于急性铅中毒,并不能完全修复铅毒性造成的组织损伤,用量大时还可引起脏器损伤[5],不适用于长期低铅暴露人群。因此,寻找安全有效防治铅中毒的排铅物质具有重要研究意义。

岩藻多糖(Fucoidan)是一种独特的结合有硫酸基团的水溶性多糖,又称岩藻聚糖硫酸酯,褐藻糖胶,主要存在于褐藻中[6]。近年来研究发现岩藻多糖具有抗凝、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤等良好的生物活性[7-9],有望将其开发成新型药物和营养保健食品。有研究表明,岩藻多糖对铅中毒大鼠体内的铅有较好促排效果[10],但是,关于岩藻多糖对铅毒性损伤机体内矿物质元素含量影响方面的研究还未见报道。因此,本研究利用岩藻多糖对铅中毒大鼠进行灌胃治疗,探讨其排铅效果及对染铅大鼠体内矿物质元素含量的影响,为后续开发岩藻多糖作为一种天然、安全、有效的铅拮抗剂提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

清洁级健康SD大鼠 60只,雌雄各半,200～220 g,购自北京华阜康生物科技股份有限公司,许可证编号:SCXK(京)2-14-0004;岩藻多糖(纯度≥98.3%) 山东洁晶集团股份有限公司;醋酸铅(色谱纯) 上海沃凯生物技术有限公司;浓硝酸(优级纯) 上海泰坦科技股份有限公司;高氯酸(优级纯) 天津市鑫源化工有限公司;二巯基丁二酸(DMSA,纯度98%) 北京百灵威科技有限公司;实验用水 均为超纯水。

Optima 5300 DV全谱直读等离子体发射光谱仪 美国铂金艾尔默股份有限公司;DigBlock ED 54消化炉 北京莱伯泰科有限公司;Neofuge 15 R台式高速冷冻离心机 上海力康生物医疗科技控股有限公司;Vortex KB3漩涡混合器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司;CPA 1003P电子分析天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司;POSEZDON-R70超纯水机 厦门锐思揭水纯化技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 岩藻多糖急性毒性试验 采用最大给药量法[11],选择健康SD大鼠20只,200～220 g,雌雄各半。试验前以岩藻多糖最大给药浓度(0.30 g/mL)及大鼠可承受的最大体积(1 mL/100 g)灌胃SD大鼠,称取12 g岩藻多糖受试物,以蒸馏水为溶剂配成浓度为0.60 g/mL的混悬液,一次灌胃给予实验动物,连续14 d,给药后4 h内,每1 h观察大鼠死亡情况,行为活动,精神状态等,并记录大鼠的毒性反应、死亡情况。

1.2.2 动物分组及给药方法 将SD大鼠饲养于SPF级实验室,动物房温度:22～26 ℃,湿度:40%～70%,人工昼夜:12 h/12 h;适应性喂养一周后,随机分为:空白对照组、模型组、阳性药物组(DMSA组)、岩藻多糖低、中、高剂量组,共6组,每组10只。

空白对照组灌胃自来水,以消除其余各组灌胃应激反应造成的影响。除空白对照组外,其余各组每日灌胃醋酸铅溶液,剂量为5 mg/kg(以Pb2+计),连续灌胃4周,建立铅中毒模型。第5周起,岩藻多糖低、中、高剂量组每日给予岩藻多糖混悬液灌胃,剂量分别为50、100、200 mg/kg;DMSA组灌胃DMSA溶液,每日灌胃剂量为25 mg/kg,连续灌胃3 d,停4 d,连续治疗4周(同临床);模型组及空白对照组灌胃等量自来水。各试验组灌胃量均为0.5 mL/100 g。每周称量大鼠体重,并根据体重调整灌胃剂量。

1.2.3 脏器系数测定 于末次给予动物受试样品24 h(禁食不禁水)后,称重,腹主动脉取血,用于全血中铅、钙、锌、铜及铁元素含量分析。处死大鼠后,快速分离股骨、肝脏、肾脏、脑各组织,称重,计算脏器系数。

式(1)

1.2.4 铅含量及钙、锌、铜、铁元素流失率的测定 采用原子吸收光谱法检测各组大鼠血液及各脏器中铅含量[12]。电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES)[13]检测各组大鼠血液及各脏器中钙、锌、铜及铁元素含量,并计算矿物质元素流失率。

式(2)

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 岩藻多糖急性毒性试验

岩藻多糖最大给药量3 g/kg下,灌胃给予受试物后,大鼠均未出现明显中毒症状,14 d内动物无死亡(表1),根据国际上公认的食品安全毒理学评价程序[14]及急性毒性分类标准,该岩藻多糖受试物样品属低毒或实际无毒物质。

表1 急性毒性试验结果Table 1 Results of acute toxicity test

2.2 大鼠脏器系数变化

由表2可知,与空白对照组对比,模型组大鼠肝脏、肾脏脏器系数极显著升高(P<0.01),可能是铅毒性造成染铅大鼠肝脏、肾脏充血,肿胀。模型组大鼠脑组织脏器系数相较于空白对照组虽有所升高,但差异性不显著(P>0.05),不具有统计意义。与模型组对比,高剂量岩藻多糖组肝脏、肾脏脏器系数显著降低(P<0.05),表明高剂量岩藻多糖的摄入在一定程度上能缓解铅毒性对肝脏、肾脏造成的毒性损伤。

表2 大鼠脏器系数(n=10)Table 2 Organ coefficient of rats(n=10)

表3 大鼠血液及各脏器中铅含量((n=10)Table 3 Contents of lead in blood and organs of rats((n=10)

2.3 岩藻多糖对铅中毒大鼠血液及各脏器铅含量的影响

血液和器官中铅含量的高低是判断模型动物是否铅中毒的主要指标之一[15]。骨骼是铅的储存库,体内90%的铅都沉积在骨骼[16],肝脏、肾脏、中枢神经系统被认为是铅产生毒害作用的主要靶器官,因而本研究以血液及股骨、肝脏、肾脏、脑组织为主要研究部位进行探讨。

由表3可知,与空白对照组相比,除脑组织外,模型组大鼠血液及各脏器中铅含量极显著升高(P<0.01),表明经过为期一个月铅染毒之后,铅在大鼠体内蓄积,分布规律为:股骨>肾脏>肝脏>血>脑,这与Lin等研究结果一致[17-18],同时说明本实验造模成功。与模型组对比,各剂量岩藻多糖组大鼠各脏器中铅含量均有所降低,其中中、高剂量岩藻多糖组大鼠肝脏、肾脏中铅含量极显著下降(P<0.01),表明岩藻多糖对染铅大鼠有明显的铅促排效果,且各剂量岩藻多糖组大鼠股骨、肝脏、脑组织数据表明,其剂量与排铅效果之间呈正相关性。与模型组对比,DMSA组大鼠血、肝脏、肾脏中铅含量极显著降低(P<0.01),表明DMSA具有较好排铅效果,这与岩藻多糖排铅效果一致,但DMSA对肾脏中铅元素促排效果优于各剂量岩藻多糖。

2.4 岩藻多糖对铅染毒大鼠血液及各脏器中钙、锌、铜和铁元素流失率的影响

铅毒性造成的损害主要是由于它能在结合位点取代Ca2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+等二价阳离子,破坏机体各种代谢途径,导致细胞功能失常,并干扰细胞内和细胞间信号传导、蛋白质折叠、凋亡、酶调节、神经递质释放等重要生物过程[19-20],因此,监测生物体内重要基本元素含量变化对评估铅毒害造成的机体损伤具有重要意义。本研究通过检测血液及靶器官中钙、锌、铜、铁四种矿物质元素含量,并计算元素流失率,以探讨岩藻多糖对铅染毒大鼠体内四种矿物质元素稳态失衡的调节作用。

由图1、图2可知,与空白对照组对比,模型组大鼠骨、肝脏、肾脏、脑组织中铜元素及肝脏、肾脏中锌元素流失严重,差异极显著(P<0.01),表明铅毒性造成大鼠机体内钙、锌矿物质元素稳态失衡;与空白对照组对比,DMSA组大鼠肝脏、肾脏钙元素与血、肝脏锌元素流失严重,差异显著(P<0.05),分别流失30.03%、28.72%和44.99%、26.41%,表明DMSA虽有排铅效果但会造成机体脏器钙、锌元素不同程度的流失;与空白对照组对比,中、高剂量岩藻多糖组大鼠骨钙、脑组织锌元素流失较为严重,差异显著(P<0.05),除骨中钙元素和肾脏、脑组织锌元素外,高剂量岩藻多糖组大鼠血液及各脏器中钙、锌元素含量与空白对照组对比无显著差异,表明岩藻多糖可有效改善铅中毒造成的大鼠血液及各脏器中钙、锌元素失衡,且其剂量越高对血液、股骨、肝脏及脑组织中钙、锌元素保护效果越好。

图1 大鼠血液及各脏器中钙元素流失率(n=10)Fig.1 Loss ratio of calcium in bloodand organs of rats(n=10)注:*与空白对照组比较,*P<0.05,**P<0.01;下同。

图2 大鼠血液及各脏器中锌元素流失率(n=10)Fig.2 Loss ratio of zinc in blood and organs of rats(n=10)

由图3、图4可知,与空白对照组对比,模型组大鼠血、肾脏铜元素及骨、肝脏、肾脏铁元素含量极显著降低(P<0.01),分别下降23.56%、58.72%和45.05%、45.75%、42.39%,说明铅中毒会造成大鼠血液及脏器中铜、铁元素严重流失。DMSA组大鼠除血铁元素外其余各脏器部位元素含量与空白对照组比较均有所降低,其中以肾脏、脑组织中铜元素流失率最为严重,其含量与空白对照组对比差异极显著(P<0.01),此外,骨中铜元素及肾脏、脑组织中铁元素同样流失严重,与空白对照组对比差异极显著(P<0.01)。与空白对照组对比,模型组大鼠肾脏中铜元素上升9.14%,差异不显著(P>0.05),表明铅毒性未对大鼠肾铜稳态造成不良影响,但铅暴露后DMSA的摄入使得大鼠肾脏铜元素流失严重,下降54.46%。与空白对照组对比,各剂量岩藻多糖组大鼠肝脏、肾脏、脑组织中铜元素含量无明显差异(P>0.05),不具有统计意义,各剂量岩藻多糖组大鼠各脏器中铁元素流失率表现出不同程度降低。表明岩藻多糖可有效改善大鼠铅中毒造成脏器中铜元素流失,对大鼠体内各脏器铜元素稳态平衡起到较好的保护作用,且其剂量越高对铅中毒大鼠铜、铁元素的保护效果越好。

图3 大鼠血液及各脏器中铜元素流失率(n=10)Fig.3 Loss ratio of copper in blood and organs of rats(n=10)

图4 大鼠血液及各脏器中铁元素流失率(n=10)Fig.4 Loss ratio of iron in blood and organs of rats(n=10)

3 讨论与结论

醋酸铅灌胃剂量的选择主要基于模拟低水平亚慢性铅暴露模式,根据每日膳食暴露量与联合国粮农组织/世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会(Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives,JECFA)规定铅每日允许摄入量(allowable daily intake,ADI)值7 μg/kg及参考Sadykov等[21]醋酸铅染毒剂量,选取5 mg/kg(以Pb2+计)为本研究染毒剂量。

本研究采用岩藻多糖作为解毒剂对铅中毒大鼠进行治疗,参照岩藻多糖急性毒性实验及Kim等[22]内容确立岩藻多糖对大鼠无可见有害作用水平值(NOAEL),选用50、100、200 mg/kg为岩藻多糖剂量。岩藻多糖给药治疗后,染铅大鼠各脏器中铅含量均明显下降,表明各剂量岩藻多糖均具有较好的铅促排效果。王进等[23]研究了岩藻多糖对铅染毒大鼠生殖系统的影响,结果表明岩藻多糖能使附睾、睾丸指数降低情况得到改善(P<0.05),对生殖系统有保护作用,而本研究探究了岩藻多糖对铅染毒大鼠主要靶器官(骨、肝、肾、脑)铅清除效果,进一步证明岩藻多糖是一种具有较好排铅效果的天然提取物。DMSA组血液、肾脏、脑组织中铜元素含量与空白对照组对比差异极其显著(P<0.01),尤其是肾脏中铜元素流失严重,可能是DMSA螯合了部分铜离子的缘故,表明DMSA虽有排铅效果,可缓解铅毒性造成损伤,但会造成机体血液及各脏器中矿物质元素流失,损伤大鼠脏器,危害机体健康,这与Bradberry等[24]研究中DMSA对肾脏中铅元素具有较高的清除率但会对肾脏造成损伤该结果一致。

钙、锌、铜、铁作为二价阳离子,与铅离子在体内存在共同的靶位点和金属酶,在机体吸收及代谢过程中存在相互竞争、拮抗的作用,影响彼此之间活性作用[25],铅离子之所以相对于其他金属离子有较强的替代能力,主要与铅的离子特性有关[26]。Ghering等研究表明Pb2+的离子半径、电负性均大于Ca2+、Zn2+,使其能够以更强的亲和力与蛋白质位点结合[27]。Zakrgynska-Fontaine等[28-29]研究表明体内钙与铅呈负相关性,过量铅元素会影响铜、锌和铁的吸收,缺铁和缺钙又会促进胃肠道对铅的吸收,最终导致元素代谢失衡。Flora等研究表明铅离子可通过取代Zn2+、Cu2+、Fe2+等抗氧化酶金属结合位点,与酶的巯基基团结合,使酶失活,进而诱导机体氧化应激[30-31]。除肾脏中铜元素外,本研究模型组大鼠血液及各脏器中钙、锌、铜、铁元素含量明显低于空白对照组,推测是由于铅离子通过竞争抗氧化酶金属结合位点在机体内蓄积,从而造成了机体损伤和各元素稳态失衡。

岩藻多糖作为阴离子多糖可与阳离子聚合物发生交联作用[32],Davis等[33]探讨了褐藻作为金属吸附剂的结合机制,岩藻多糖分子含有羧基、硫酸基等酸性官能团,能够与Hg2+、Cr2+、Pb2+等二价重金属发生螯合作用,是一种有效的生物吸附材料。Becker等[34]研究表明岩藻多糖可通过与铁、锌等重金属形成金属复合物从而抑制肠腔对重金属的吸收。Ferreira等[35]研究表明岩藻多糖中硫酸基作为阳离子印记基质对Pb具有很高的吸附性能和结合强度。本研究结果表明岩藻多糖对染铅大鼠具有较好的促排效果,能有效改善染铅所致大鼠体内矿物质元素流失,推测可能是岩藻多糖含有的羧基、硫酸基等官能团具有比巯基基团更强的铅离子结合能力,使岩藻多糖竞争性螯合铅离子,而后经机体代谢排出体外,从而达到明显的促排效果。目前关于岩藻多糖在生物体内的铅促排机理尚未明确,还需进一步深入研究。

综上所述,本研究探讨了岩藻多糖对铅中毒大鼠体内铅及矿物质元素钙、锌、铜、铁含量的影响,结果表明岩藻多糖对铅中毒大鼠体内蓄积的铅有较好的促排作用,同时还可有效缓解铅毒性造成的体内矿物质元素稳态失衡。该研究有望将岩藻多糖开发为一种促排铅保健功能食品,不仅可以充分利用我国丰富的褐藻资源,加大褐藻资源开发利用的深度和附加值,而且为岩藻多糖功能活性的深入研究提供科学依据。