(内蒙古科技大学包头医学院,内蒙古包头 014060)

肾纤维化(renal fibrosis)几乎是各种致病因素导致的肾脏疾病进展到后期的共同结果,是各种慢性肾脏疾病发展到终末期的主要病理学表现之一[1]。从中医学的角度来看,肾纤维化起因是外邪侵袭,正气不足、疲血阻络、正气不足为病机之本,夹实邪为病机之关键,湿、毒、虚、瘀贯穿疾病始终。早期防治乃至尽早逆转肾纤维化防治肾病发展是治疗肾纤维化的最终目标,具有深远的社会意义。

蒙古扁桃(Amygdalusmongolica)蒙名为乌兰-布衣勒斯[2],为主要的木本油料树种之一,其油可供食用。蒙古扁桃作为传统的中药,性平、味苦,具有利尿消肿作用,能行全身之水气,改善阴虚,因此,对蒙古扁桃在防治肾纤维化方面进行研究,为抗纤维化药物的挖掘具有十分重要的意义。近年来对蒙古扁桃化学成分研究表明,蒙古扁桃中含有不饱和脂肪酸、苦杏仁苷、有机酸类、蛋白质、黄酮类、多糖类、生物碱类及α-VE等多种药用成分[3-8]。中药因其成分复杂,作用于多种靶细胞起效,在治疗过程中发挥整体的优势。现代研究表明,不同器官纤维化虽然发病的组织器官不同,但是发病机制和脏器的实质性病理改变在一段时间内是相同的[9]。课题组前期已证实蒙古扁桃具有较好防治肝、肺、肾纤维化作用[10-11],但抗肾纤维化具体有效作用部位有待进一步明确。

本文在以往研究的基础上,采用单侧输尿管结扎术制备模型,测定各实验组大鼠24 h尿量,肾系数,血清和肾组织超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、羟脯氨酸(HYP)、血清中肌酐(Scr)、白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)等,筛选蒙古扁桃药材抗肾纤维化的具体作用部位,为深度利用蒙古扁桃资源、进一步开发蒙古扁桃新的药理作用及抗纤维化药物的挖掘提供科学依据和理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蒙古扁桃药材 采自内蒙古阿拉善盟巴彦诺日公,由包头医学院石松利教授鉴定为蒙古扁桃;实验动物:雄性SPF级SD大鼠70只 购回时体质量170～200 g,购自北京大学医学部实验动物科学部,许可证号SCXK(京)2017-0005;盐酸贝那普利 北京诺华制药有限公司;戊巴比妥钠 德国默克公司;羧甲基纤维素钠 分析纯,天津市凯通化学试剂有限公司;注射用青霉素钠 华北制药股份有限公司;MDA试剂盒、SOD试剂盒、HYP试剂盒、总蛋白定量测定试剂盒、Masson染色试剂盒、Scr试剂盒、BUN试剂盒、ALB试剂盒等 南京建成生物工程研究所。

酶标仪 赛默飞世尔科技有限责任公司;一次性使用真空采血管 江苏宇力医疗器械有限公司;MS-700研磨机 宁波美善美心电器有限公司;AU640 全自动生化分析仪 日本奥林巴斯公司;XH6080 放免仪 西安核仪厂;TGL-16M 型高速台式冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;NP-T 生物组织自动脱水机 孝感市诺普电子科技有限责任公司;NP-B 型生物组织包埋机 孝感市诺普电子科技有限责任公司;RM2235 切片机 德国徕卡公司;JP-031S数字型超声波清洗机 深圳市结盟清洗设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 蒙古扁桃药材不同极性提取物的制备 将蒙古扁桃种仁去外壳,研碎后,置于索氏提取器中,用10倍量的95%乙醇、90 ℃水浴提取2次,每次2 h;再用10倍量的70%乙醇提取1次,每次2 h,得粗提液[12]。用减压蒸发装置和水浴锅浓缩提取液至浸膏状,计算出膏率,出膏率=浸膏重量/药材投入量×100,为21.06%。粗浸膏使用超声波清洗机振荡使其均匀分散于蒸馏水中,依次用极性由小到大的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,合并相同极性部位的萃取液[13]减压浓缩后计算各部分提取物得率,各部分提取物得率=各部分萃取物重量/粗浸膏重量。计算结果分别为:石油醚提取物56.45%,乙酸乙酯提取物2.08%、正丁醇提取物30.76%、水提取物10.71%。

1.2.2 动物分组及给药剂量 大鼠购回适应性饲养1周,动物饲养室温度为22～27 ℃,相对湿度为50%±5%,每组10只,随机分为7组,分为假手术组、模型组、贝那普利组、石油醚提取物组、乙酸乙酯提取物组、正丁醇提取物组和水部位组。大鼠于造模前给药,蒙古扁桃药材提取物不同极性部位组均按生药量1.5 g/kg大鼠体重灌胃给药[12]。阳性药盐酸贝那普利按1.5 mg/kg大鼠体重灌胃给药,假手术组和模型组5 mL/kg大鼠体重灌胃生理盐水,每天一次,自由饮食,观察大鼠的基本情况及死亡情况,21 d后处死大鼠。

1.2.3 模型制备 本实验采用成熟稳定而且重现性良好的单侧输尿管结扎术制备大鼠肾纤维化模型[14],根据体重按35 mg/kg给予3%戊巴比妥钠腹腔注射进行麻醉,固定于鼠板上,将手术用器械用75%酒精擦拭消毒,手术区域脱毛备皮,用碘酒消毒手术区域后,将大鼠仰卧固定于鼠板上,沿大鼠左肋骨边缘下方1.5 cm处向外横切口2 cm,剪开外皮后分离腹膜,暴露左肾,用镊子钝性剥离左肾周围的脂肪、筋膜等组织,分离出左侧输尿管后用手术缝合线进行结扎,结扎后再逐层缝合大鼠皮毛组织,假手术组仅游离左侧输尿管,不结扎,最后将青霉素钠溶液涂于伤口防止伤口感染。

1.2.4 样本采集 造模手术21 d后,禁食不禁水,于末次给药 24 h 后,眼眶静脉丛采血,测定Scr、BUN、ALB,然后置于代谢笼内接取24 h尿量后再称大鼠体重后,用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后,仰卧位固定于鼠板上,打开腹腔,先取腹主动脉血,再摘取双侧肾脏,观察结扎侧肾脏外观颜色、质地、形态等情况,用生理盐水清洗后,滤纸擦去水分,用电子天平称左侧肾的重量,计算肾系数。从左侧肾脏横切一半组织固定于4%甲醛溶液中,做病理切片。另一半用于制备肾组织匀浆,检测组织匀浆中SOD、MDA、HYP。所采腹主动脉血液置于4 ℃冷冻离心机中,3000 r/min、10 min分离血清,检测血清SOD、MDA。

1.2.5 指标测定

1.2.5.1 大鼠的一般情况 每天观察记录各组大鼠的皮毛颜色变化、进食饮水量、排泄情况以及活动情况。

1.2.5.2 观察肾组织形态学变化 观察双侧肾脏的颜色、质地、形态、体积等外表变化。

1.2.5.3 记录大鼠24 h尿量计算肾系数 收集各组大鼠24 h尿量并记录;处死大鼠后摘取梗阻侧肾脏,称重,计算肾系数(肾系数(%)=梗阻侧单侧肾脏质量/体质量×100)。

1.2.5.4 观察肾脏病理组织学结果 对梗阻侧肾脏病理切片进行HE和Masson染色后,置于光学显微镜下观察肾脏病理组织学变化,并记录结果。

1.2.5.5 测定大鼠血清Scr、BUN、ALB含量 根据试剂盒的指示步骤进行含量测定,计算结果并做详细记录。

1.2.5.6 测定大鼠血清SOD活力、MDA含量 根据试剂盒的指示步骤进行含量测定,计算结果并做详细记录。

1.2.5.7 测定大鼠肾组织 SOD活力、MDA和HYP含量 根据试剂盒的指示步骤进行含量测定,计算结果并做详细记录。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 肾纤维化大鼠模型造模结果

各组大鼠造模21 d后,采血,测定其肾纤维化相关指标,实验结果见表1。由表1可知,与假手术组相比,肾纤维化模型组、阳性盐酸贝那普利药组及蒙古扁桃药材不同极性提取物组大鼠血清中的BUN、Scr、ALB含量均显著升高(P<0.05),表明模型组大鼠存在肾脏代谢紊乱,肾纤维化模型造模成功。

表1 肾纤维化大鼠模型造模结果Table 1 Modeling results of rat

2.2 大鼠的一般情况

单侧输尿管结扎手术后1 h内各手术组大鼠均苏醒,刚苏醒后精神状态较差,短时期内活动量减少,手术伤口没有出现感染。手术后的假手术组大鼠,前期进食及饮水较术前稍减少,恢复几天后机体逐渐恢复至正常。模型组大鼠术后饮食减少,毛色发黄,精神低靡,活动行为迟缓。

2.3 大鼠肾脏的形态学变化

处死大鼠后摘取各个脏器,观察双侧肾脏(图1),可见假手术组大鼠的双侧肾脏外观色泽正常,呈扁豆状,双侧大小基本一致,呈紫红色,组织富有弹性,被有光滑的薄膜,切开时阻力很小,切面经生理盐水漂洗后可见皮质髓质分界清楚。模型组大鼠梗阻侧肾脏与正常侧肾相比,体积明显增大,浅褐色,呈囊状,肾组织内有积液,被有凹凸不平的白色薄膜,切开时阻力较大,有黄褐色的液体流出。观察各处理组肾脏切开后经生理盐水漂洗后的切面可见皮质部分变薄,皮髓质分界模糊不清,其中模型组最为严重,蒙古扁桃石油醚、正丁醇提取物组和阳性药组上述情况有所改善。

图1 蒙古扁桃不同极性提取物对肾纤维化大鼠肾脏形态学的影响Fig.1 Morphological changes of kidney in rats with renal fibrosis induced by different polar extracts of Amygdalus mongolica

2.4 24 h尿量和肾系数计算

由图2可知,模型组大鼠与假手术组大鼠相比,24 h尿量极显著减少(P<0.01),肾系数极显著升高(P<0.01),说明模型稳定,造模成功;与模型组相比,阳性药组大鼠24 h尿量极显著增加(P<0.01),蒙古扁桃正丁醇提取物大鼠24 h尿量显著增加(P<0.05),阳性药组、蒙古扁桃石油醚和正丁醇提取物组的肾系数显著降低(P<0.05)。以上结果表明,蒙古扁桃石油醚提取物和正丁醇提取物对肾纤维化大鼠具有保护作用。

图2 蒙古扁桃不同极性提取物对肾纤维化大鼠尿量和肾系数的影响Fig.2 Effects of different polar extracts ofAmygdalus mongolica on urine volume and renalcoefficient in rats with renal fibrosis(x±s,n=10)注:##:与假手术组相比,差异极显著,P<0.01;*:与模型组相比差异显著,P<0.05,**:与模型组相比差异极显著,P<0.01;模:模型组,假:假手术组,阳:阳性药组,石:石油醚提取物组,乙:乙酸乙酯提取物组,正:正丁醇提取物组,水:水部位组;图5～图7同。

2.5 肾纤维化大鼠病理组织学结果

图3病理切片HE染色镜下观察显示:假手术组大鼠肾组织的肾小球、肾小管结构均正常,未出现异常病变,模型组肾小管损伤范围较大,间质内可见片状分布的炎性细胞,有灶状纤维化出现,蒙古扁桃药材不同极性部位提取物给药组的肾组织中肾小管及肾间质病变也随着时间逐渐加重,阳性药组、石油醚提取物组与正丁醇提取物组相比模型组病变较轻,肾间质中炎性细胞减少。

图3 蒙古扁桃不同极性提取物对肾纤维化大鼠肾脏病理组织学的影响(HE染色,200×)Fig.3 Effect of different polar extracts of Amygdalus mongolicaon renal histopathology of rats with renal fibrosis(HE staining,200×)

图4 Masson染色镜下观察显示:假手术组大鼠的肾小球、肾小管结构均未见异常病理改变;模型组大部分肾小管出现明显萎缩,间质变宽,充满炎性细胞,可见灶状纤维化的出现。蒙古扁桃石油醚提取物组、正丁醇提取物组及阳性药组肾组织中肾小管及肾间质均产生病变;与模型组相比,蒙古扁桃石油醚提取物组,正丁醇提取物组的肾间质炎性细胞浸润减轻,肾小管较轻损伤,间质纤维化程度减弱,可以直观地观察到蒙古扁桃石油醚提取物和正丁醇提取物以及盐酸贝那普利对肾纤维化大鼠具有保护作用。

图4 蒙古扁桃不同极性提取物对肾纤维化大鼠肾脏病理组织学的影响(Masson染色,200×)Fig.4 Effects of different polar extracts of Amygdalus mongolica on renalhistopathology in rats with renal fibrosis(Masson staining,200×)

2.6 血清中BUN、Scr、ALB含量结果

如图5所示,模型组与假手术组相比,血清中BUN、Scr、ALB含量极显著增高(P<0.01);与模型组相比,阳性药贝那普利组大鼠血清中的BUN、Scr、ALB水平显著降低(P<0.05),而蒙古扁桃正丁醇提取物组大鼠血清中的BUN、ALB水平显著降低(P<0.05),Scr水平极显著降低(P<0.01);石油醚提取物组大鼠血清中Scr和ALB的水平显著降低(P<0.05)。以上结果表明,蒙古扁桃石油醚提取物和正丁醇提取物对肾纤维化大鼠的肾脏具有保护作用。

图5 蒙古扁桃不同极性提取物对肾纤维化大鼠血清BUN、Scr、ALB的影响Fig.5 Effects of different polar extracts ofAmygdalus mongolica on serum BUN,Scrand ALB in rats with renal

2.7 血清中SOD活力和MDA含量结果

如图6所示,与假手术组相比,模型组血清中的SOD活力极显著降低(P<0.01),血清MDA含量极显著升高(P<0.01);与模型组相比,蒙古扁桃石油醚提取物组、正丁醇提取物组和阳性药盐酸贝那普利组的大鼠血清中SOD活力显著升高(P<0.05),蒙古扁桃石油醚提取物组和正丁醇提取物组的大鼠血清中MDA含量显著降低(P<0.05),阳性药盐酸贝那普利组的大鼠血清中MDA含量极显著降低(P<0.01)。

图6 蒙古扁桃不同极性提取物对肾纤维化大鼠血清SOD、MDA的影响Fig.6 Effects of different polar extracts ofAmygdalus mongolica on serum SOD and MDAin rats with renal

2.8 肾组织中SOD活力和MDA、HYP含量结果

如图7所示,与假手术组相比,模型组肾组织中SOD活力极显著降低(P<0.01),MDA、HYP水平极显著升高(P<0.01);与模型组相比,蒙古扁桃石油醚提取物组、正丁醇提取物组和阳性药盐酸贝那普利组大鼠肾组织中的SOD活力显著升高(P<0.05),MDA、HYP水平显著降低(P<0.05)。

图7 蒙古扁桃不同极性部位提取物对大鼠肾组织中SOD、MDA和HYP的影响Fig.7 Effects of extracts from different polar parts ofAmygdalus mongolica on SOD,MDAand HYP in rat

3 结论与讨论

综合本研究结果筛选出蒙古扁桃药材提取物抗肾纤维化的有效作用部位是石油醚部位和正丁醇部位。肾纤维化是各种慢性肾脏疾病进展为终末期肾病的常见病理学结果,其特征主要包括肾小管萎缩,炎性细胞浸润,纤维母细胞/肌成纤维细胞激活,细胞外基质的产生和降解无法处在动态平衡状态中[15-17]。纤维化是细胞、组织损伤修复的结果,主要病理改变为器官组织内纤维结缔组织增多,实质细胞减少。内源性或外源性致病原引起肾组织损伤,启动机体保护性的炎症反应与修复过程,造成机体代谢紊乱,从而使肾功指标和血清内各项生化指标出现异常。

本研究的造模方法采用的是单侧输尿管结扎手术,来制备大鼠肾纤维化的模型,单侧输尿管结扎术所导致的大鼠肾纤维化模型,是目前广泛采用的公认的可以诱导肾间质纤维化病变的造模方法,是一种符合临床慢性肾衰特点的经典动物造模方法。阳性药物对照选用的是盐酸贝那普利,属于肾素-血管紧张素-醛固酮系统抑制药,抑制血管紧张素Ⅱ的形成,可使血浆醛固酮水平降低、使血管舒张、降低血压,缓解机体内的氧化应激反应、增加肾小球滤过率、减少蛋白尿等发挥肾脏保护作用[18-20]。本研究通过对肾脏病理组织切片HE和Masson染色,在显微观察蒙古扁桃不同极性提取物对模型大鼠肾脏结构的改变,同时评估大鼠尿量,肾脏脏器指数,BUN、Scr及ALB水平,检测大鼠血清中SOD、MDA的表达,组织中SOD、MDA及HYP的表达,从多个环节筛选出蒙古扁桃药材抗肾纤维化的有效作用部位是石油醚部位和正丁醇部位,为进一步开发蒙古扁桃新的药理作用及抗纤维化药物的挖掘提供科学依据和理论基础。

肌酐(Scr)是生物体肌肉内的磷酸肌酸经过水解而生成的,在生理状态稳定的机体内肌酐的产生与代谢正常,但当由各种因素导致肾脏病变后,肾小球的滤过率会降低,机体内肌酐的含量相比于正常机体会明显升高。机体内蛋白质代谢的终末产物是尿素氮,正常情况下血液中的尿素氮可以全部经肾小球滤过后,被肾小管重吸收,当肾脏受到损伤,体内尿酸排出减少,产生蓄积,造成血液中的尿素氮水平升高[21-25]。所以血清中肌酐、尿素氮的水平波动可以在一定程度上反映肾小管的病变程度。氧化应激反应与肾纤维化密切相关,羟脯氨酸胶原蛋白的主要成分之一,其羟脯氨酸含量与肾间质纤维化严重程度密切相关[26]。本次研究结果显示,蒙古扁桃药材石油醚提取物给药组与正丁醇给药组的血清与组织SOD活性与模型组相比显著升高(P<0.05),血清及组织中MDA水平则显著降低(P<0.05),蒙古扁桃药材石油醚提取物和正丁醇提取物可能具有清除机体内活性氧和抵抗脂质过氧化作用来维持机体正常代谢。