王登峰，李建军，刘志强，翁业斌，葛建军，杨学云，吴建勇

(1.新疆畜牧科学院兽医研究所，乌鲁木齐 830013；2.新疆呼图壁种牛场有限公司，新疆昌吉 831100)

0 引 言

【研究意义】奶牛乳腺炎是奶牛的多发病，我国临床型奶牛乳腺炎的年头发病率在2.3%～16.7%，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)是奶牛乳腺炎的主要传染性致病菌之一[1, 2]。该菌的常规分离方法是将乳样接种于5%～7%的绵羊血琼脂平板过夜培养，根据菌落的溶血和形态挑取疑似菌落扩大培养，通过生化试验或分子生物学方法进行最终鉴定[3, 4]。该方法靶向性差，且平板培养的敏感性低而导致分离率低；为提高靶向性，可以使用分子生物学方法先对乳样进行SA检测，阳性样本再进行常规方法分离、鉴定[4]，此方法费用较高；一些实验室直接使用CHROM SA显色培养基等选择性培养基进行分离、鉴定[5, 6]，但仍存在琼脂平板培养敏感性低、选择性培养基价格普遍高等问题。【前人研究进展】同时，SA在临床型、隐性乳腺炎样本中的分离率普遍介于30%～50%，随机奶样中的分离率介于20%～50%[1]，表明虽然SA 感染可导致临床型乳腺炎的发生，但不是所有感染SA的乳腺必然发生临床型乳腺炎[7, 8]，建立准确评估SA感染与临床型乳腺炎发生的相关性是控制SA性临床乳腺炎的重点。已有研究证实SA感染导致的临床型乳腺炎与感染菌株的毒力正相关[9, 10]，所以准确评价SA毒力是判断是否导致临床型乳腺炎发生的关键。此外，通过调查牛场中SA菌群的毒力分布可以评估养殖场发生临床型乳腺炎的风险。【本研究切入点】目前评价细菌分离株毒力的方法主要是通过小鼠腹腔注射[3]或肌肉注射[11, 12]纯培养物，观察感染后小鼠死亡数量、死亡时间和病变程度等进行评价，该方法虽然简单、直观，但是对于毒力差异较大，中、弱毒力菌株小鼠致死率较低的SA菌株，用该方法进行评价则比较困难，并且需要耗费大量实验动物，耗时长、费用也较高。研究建立可以定量测定SA主要致病因子溶血素的分泌量，进而评价菌株毒力的方法。【拟解决的关健问题】使用葡萄球菌选择培养基mBP培养液结合CHROM SA显色培养基对乳样中的SA进行靶向分离，结合定量测定SA主要致病因子溶血素进而评价菌株毒力的技术，建立可适用于生产的SA感染情况调查和致临床乳腺炎发生风险的评估方法。

1 材料与方法

1.1 材 料

根据临床检查或隐性乳腺炎检查法(CMT法)[13]检测结果，初步判断患临床型、隐性乳房炎奶牛和健康泌乳牛(SCC<30万)。以常规挤奶法弃掉前3把奶，用常规消毒液消毒乳头及其附近区域，再用酒精棉球消毒乳头。打开灭菌试管盖，将试管保持水平状态，将奶样挤入试管中，盖好试管盖，冷藏运回实验室。

2017年8～12月间，选取新疆昌吉州4个千头规模的奶牛养殖场，共采集未经治疗的临床型乳腺炎乳样64份、隐性乳腺炎乳样(SCC≥30万)157份和健康乳样(SCC<30万)213份[14]。

1.2 方 法

1.2.1 培养基制备

葡萄球菌选择培养液为mBP 培养液[15-16]，配方专利检索号为(200610038812.0)，具体配制过程为：先将10 g蛋白胨、5 g酵母粉、10 g丙酮酸钠、12 g甘氨酸、5 g氯化锂完全溶解于980 mL水中，再用氢氧化钠溶液调pH至7.3，然后，于121℃下灭菌，冷却至(50±10)℃时加入无菌1%亚碲酸钾溶液10 mL和7 mL吐温80，5 mL灭菌管，无菌分装为2 mL/支，4℃保存。

科码嘉金葡菌显色培养基(CHROM SA培养基)购自北京赛为思生物技术开发中心，配制方法按照说明书进行。

改良哥伦比亚液体培养基配制：哥伦比亚液体培养基(Gibco干粉培养基，赛默飞世尔科技(中国)有限公司)，添加1.5%氯化钠，用0.1 moL/L氢氧化钠或盐酸调节pH值为7.0～7.5，在0.11 MPa压力下灭菌20 min ，冷却至(45～50℃)，按10%比例添加小牛血清(四季青，浙江天杭生物科技股份有限公司)混匀，10 mL灭菌管，无菌分装为2 mL/支，4℃保存。

1.2.2 选择性分离培养

采集的奶样颠倒混匀后取100 μL接种 mBP 培养液中颠倒混匀，37℃培养18～24 h ，选择培养液明显浑浊并有黑色产物培养管，取50 μL涂布或划线接种于科码嘉金葡菌显色培养基上，37℃培养24 h，SA菌落表现为紫红色、红色、粉红色；挑取单菌落接种于改良哥伦比亚液体培养基于37℃、150 r/min振摇培养20 h。

1.2.3 金黄色葡萄球菌毒力的快速评估

金黄色葡萄球菌分泌性溶血素的测定参见《一种可定量测定细菌分泌性溶血素活性的测定方法》，申请号：201710342810.9[17]。

1.2.3.1 试剂配制

贮存液：十二水磷酸氢二钠 2.85 g、磷酸二氢钾 0.27 g、氯化钠17.00 g、加蒸馏水至100 mL，0.22 μm滤膜过滤后，4℃保存。

应用液：5 mL贮存液加95 mL蒸馏水，再加10%硫酸镁0.1 mL，12 h内使用。

血细胞保存液：葡萄糖2.05 g，柠檬酸钠0.8 g，氯化钠0.42 g，蒸馏水100 mL，以上成分混匀后，微加温溶解后，用柠檬酸钠调节pH至6.1，并分装在三角瓶中，115℃湿热灭菌15 min。

1%绵羊红细胞制备：无菌采取绵羊血液在等量的血细胞保存液中。使用前用3到10倍体积的应用液洗3次。1 500 r/min，前2次离心5 min，最后一次离心10 min。吸弃上清液，并使用应用液制成1%的细胞悬液。

1.2.3.2 毒力评价

使用定量测定SA分泌性溶血素活性的方法[17]对分离株进行毒力评估，可选用试管法和微孔法，试验采用微孔法，详细操作如下：

待测样本准备：金黄色葡萄球菌分离株单菌落经改良哥伦比亚液体培养基150 r/min振摇培养20 h后，取培养物1 mL，以8 000×g离心5 min，取500 μL上清，4℃可保存24 h，-80℃可保存60 d。

细菌溶血素量微孔法测定操作：

(1)稀释毒素：待测毒素50 μL，应用液5 mL，稀释度为1∶100。

(2)配制溶血标准孔：1%绵羊红细胞800 μL加1 200 μL蒸馏水，混匀，即为全溶血孔，取250 μL加入全溶血孔。取全溶血孔液600 μL加应用液600 μL，即为50%溶血孔，取250 μL加入50%溶血孔，并使用同体积的应用液作空白对照孔。

(3)稀释的待测毒素、缓冲液和红细胞依次加入反应孔中(“V”型底微孔板较为合适)，混匀，置37℃水浴30 min。第0管为非溶血对照孔。每个孔做3个以上复孔。表1

表1 微孔法测定细菌毒素VH50Table 1 Bacterial toxin VH50 determined by microplate method

(4)结果测定：取出微孔板，800×g离心5 min，另取“U”型底微孔板，每孔吸取100 μL 到对应的“U”型底微孔板中，对照孔应不溶血。用分光光度计测(波长542 nm)OD值，计算复孔平均值，确定与标准50%溶血孔第1接近孔为终点孔，与终点孔紧邻且与标准50%溶血管的OD542值第2接近孔为次终点孔，根据终点孔和次终点孔建立Y(OD542值)=aX(待测毒素添加量)+b线性方程，根据标准50%溶血管的OD542值计算待测毒素用量。然后按下公式计算VH50值：

细菌溶血素量(VH50 U/mL)=(1,00/毒素用量)×稀释度。

乳样中分离的SA单菌落接种于2 mL改良哥伦比亚液体培养基于37℃、150 r/min振摇培养20 h后，培养上清中的溶血素量普遍在300～3 000 VH50 U/mL[17]，结合小鼠的毒力评价试验[18]，初步确定：溶血素分泌量≥1 500 VH50 U/mL为强毒力菌株，溶血素分泌量介于1 000～1 500 VH50 U/mL为中等毒力菌株，溶血素分泌量<1 000 VH50 U/mL为弱毒力菌株。

1.3 数据处理

使用斯皮尔曼等级相关系数(Spearman correlation coefficient)分析菌株毒力与临床型、隐性乳房炎和健康泌乳牛样本之间的关系。计算公式为：

其中，n为样本数，di=xi-yi.

2 结果与分析

研究表明,乳样经葡萄球菌选择培养液(mBP培养液)培养，呈现明显浑浊并有黑色产物的试管表明样本中存在葡萄球菌，临床型乳腺炎乳样、隐性乳腺炎乳样和健康乳样中mBP培养阳性率分别为64.1%、47.9%和20.2%。将mBP阳性培养物进一步划线接种到CHROM SA显色培养基，SA菌落颜色为紫红色、红色、粉红色。经过靶向分离，分别从采集的3类样本中分离出SA菌株27株、21株和17株，分离率为42.2%、13.4%和8.0%。表2

挑取CHROM SA显色培养基上阳性单菌落接种于改良哥伦比亚液体培养基，按照设定条件培养后，使用微孔法测定各菌株的溶血素分泌量，并将溶血素分泌量设定为3个范围：≥1 500 VH50 U/mL、1 000～1 500 VH50 U/mL和<1 000 VH50 U/mL，分别对应为强毒力、中等毒力和弱毒力。结果显示分离于3种类型的样本中，溶血素分泌量≥1 500 VH50 U/mL的菌株分别为9株(33.3%)、1株(4.8%)和2株(11.8%)、溶血素分泌量在1 000～1 500 VH50 U/mL的菌株：1株(4.8%)、13株(61.9%)和4株(23.5%)、溶血素分泌量在<1 000 VH50 U/mL的菌株：2株(11.8%)、7株(33.3%)和11株(64.7%)。经斯皮尔曼等级相关系数分析，临床乳腺炎的发生与溶血素分泌量≥1 500 VH50 U/mL(ρ=0.5，P=0.006 7)和≥1 000 VH50 U/mL(ρ=1，P=0.006 9)的SA(中、强毒力菌株)感染呈极显著正相关；与溶血素分泌量介于1 000～1 500 VH50 U/mL的SA(中毒力菌株)感染呈显著正相关(ρ=0.5，P=0.021)，与溶血素分泌量<1 000 VH50 U/mL的SA(弱毒力菌株)感染呈不显著负相关(ρ=-1，P=0.10)。

表2 不同类型乳样中金黄色葡萄球菌的靶向分离和溶血素量分泌Table 2 Targeted isolation and hemolysin secretion of Staphylococcus aureus in different milk samples

注：1 培养液明显浑浊并有黑色产物；2 菌落颜色为紫红色、红色、粉红色
Note.1.The culture medium was obviously turbid and had black products; 2.The colony color was purplish red, red or pink

3 讨 论

金黄色葡萄球菌(SA)是奶牛乳腺炎的主要传染性致病菌之一，该菌的常规分离方法较多[19, 20]，研究中使用葡萄球菌选择培养基mBP 培养液进行选择性增菌，由于mBP培养液分离SA的灵敏度为60个细菌[15]，经扩增培养后，再使用CHROM SA显色培养基进行单菌落分离使分离效率较大提高，也降低了费用，适合奶牛养殖场中SA感染调查。同时建立快速测定细菌分离株溶血素产量的毒力评价方法，不依赖实验动物，通过分离株的毒力评估感染牛发生临床型乳腺炎的风险。

金黄色葡萄球菌可产生溶血毒素、肠毒素、血浆凝固酶、耐热核酸酶等毒素，产生毒素量和生物活性的差异使不同菌株的致病力差异较大[21-23]，其中溶血素是SA的主要毒素之一[23]。细菌分泌的溶血素可以溶解(穿孔)绵羊血红细胞，当红细胞和溶血素量一定时，在规定反应的时间内，溶血程度与溶血素量和生物活性呈正相关。在接近50%的红细胞溶血(VH50)时，二者之间近似直线关系，由此定义引起1 mL，1%浓度的完整绵羊红细胞中50%的细胞溶血所需的最小毒素量为一个VH50 U，据此计算出待测细菌液体培养时上清中分泌的溶血素的量。在相同的培养条件下，可以通过比较相同细菌数量的溶血素产量确定不同分离株的毒力差异。研究结合小鼠后肢肌肉攻毒、根据病变指数评分的毒力评价试验[18]，初步确定：SA溶血素分泌量≥1 500 VH50 U/mL为强毒力菌株，溶血素分泌量介于1 000～1 500 VH50 U/mL为中等毒力菌株，溶血素分泌量<1 000 VH50 U/mL为弱毒力菌株。

目前，淘汰SA感染导致的临床型乳腺炎患病牛，逐步根除SA在牛群中的感染是控制奶牛乳腺炎的重要方案。在我国，SA 在临床型、隐性乳腺炎样本中的分离率普遍介于30%～50%，随机奶样中的分离率介于20%～50%[1]，表明该方案对大部分牛场并不适用。临床乳腺炎的发生与微生物的感染、挤奶等物理因素和奶牛自身的遗传等多种因素相关，研究采用斯皮尔曼等级相关系数(ρ)分析临床乳腺炎和不同溶血素分泌量菌株的相关性。斯皮尔曼等级相关系数(ρ)是反映两组变量之间联系的密切程度，ρ∈(1，-1)，当ρ=1时表示临床乳腺炎和溶血素分泌量秩次完全相同；当ρs=-1时，表示两者的秩次完全相反；当ρs=0时，则两者不相关。对临床型乳腺炎乳样、隐性乳腺炎乳样和健康乳样中分离的SA使用建立的方法进行定量溶血素测定，经斯皮尔曼等级相关系数分析发现，临床乳腺炎与感染溶血素分泌量≥1 000 VH50 U/mL(中、强毒力)菌株比例的秩次完全一致(P=1)，即呈正相关；与溶血素分泌量<1 000 VH50 U/mL(弱毒力)菌株感染比例的秩次完全相反(P=-1)，即呈负相关。一旦感染乳腺中分离出中、强毒力SA，其发生临床型乳腺炎的风险较大；同时，根据奶牛养殖场中SA的感染数据和菌群中、强毒力菌株的流行情况可以初步预测临床型奶牛乳腺炎的年头发病率。

对规模化奶牛养殖场，每年使用该方法开展1～2次的SA感染率和菌群毒力调查，对中、强毒力菌株进行药物敏感性试验，可初步预测临床型奶牛乳腺炎的年头发病率，使用筛选的敏感抗生素治疗可减小乳腺炎的治疗周期和提高治愈率，并且通过彻底治愈、杀灭患病牛携带的耐药菌株，减少耐药株的扩散。

研究未考虑不同菌株增殖速度的差异，未计算相同细菌数量时的溶血素产量。在建立测定溶血素量的试验中发现在相似的接种量(单菌落)和一致的培养条件下，同一菌株的测试结果比较稳定，不同菌株的细菌数量有差异，但其导致的各菌株的溶血素量测定结果与相同细菌数量下测定的结果相比，变化范围绝对值介于10～100 VH50 U/mL[17]，不影响毒力的判断。方法中采集的各种类型的乳样数量和与各类型样本相关联的SA菌株数量仍较少，需要在临床上进一步补充样本量。

4 结 论

建立了葡萄球菌选择培养基结合CHROM SA显色培养基高敏感度(60 cfu)靶向分离乳样中金黄色葡萄球菌的方法，并建立了定量测定分泌性溶血素评价金黄色葡萄球菌毒力的方法，金黄色葡萄球菌性临床型乳腺炎的发生与感染中、强毒力菌株(溶血素分泌量≥1 000 VH50 U/mL)呈正相关，与感染弱毒力(溶血素分泌量<1 000 VH50 U/mL)菌株呈负相关。