车玉红 ,杨 波,郭春苗 ,木巴热克·阿尤普 ,吴津蓉,杜 鹃

(1.新疆农业职业技术学院, 新疆昌吉 831100；2.新疆农业科学院园艺作物研究所, 乌鲁木齐 830091)

0 引 言

【研究意义】榅桲(CydoniaoblongaMill.)，俗称木梨、新疆木瓜、比也等，为蔷薇科榅桲属植物，具有重要的药用价值和经济价值[1]。榅桲是新疆古老的栽培果树，主要分布在天山以南沿塔里木盆地边缘的绿洲，栽培面积在1 000 hm2以上。榅桲果肉呈高度木质化状态，严重影响了其作为水果鲜食的口感[2,3]。【前人研究进展】榅桲果实果肉的木质化与木质素的合成、转运及沉积密切相关。肉桂醇脱氨酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD),是木质素合成途径中的重要的限速酶，它是催化木质素单体合成最后一步反应的关键酶[4]，同时CAD是比较理想的用于改良植物品质的基因。近年来国内外学者对CAD基因进行了多方面的研究，目前已经从高粱[5]、水稻[6]、短柄草[7]、小麦[8]、杨树[9]等多种植物中克隆得到CAD基因，并且还研究发现CAD的基因的表达和CAD酶活性在芽、叶、枝、根等不同组织中活性和表达量有明显差异。R Blanco-Portales等[10]在草本水果草莓、Shan L L等在木本水果枇杷[11]果肉中研究都发现了CAD基因在调节果实发育和影响果实品质方面同样发挥着重要作用。目前，关于榅桲的研究主要集中在营养成分[3]、香气[12]、果实要用价值[13-15]等。【本研究切入点】但在果肉木质素形成与CAD基因的关系等方面的研究还未见报道。研究榅桲果实CAD基因的克隆、序列分析及表达。【拟解决的关键问题】以榅桲果肉为研究对象，通过RT-PCR、基因克隆和定量PCR技术，鉴定榅桲果肉中CAD基因的序列信息，分析CAD基因在榅桲果实发育过程中的表达变化规律，榅桲果实木质素形成机理提供新的依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

材料采自新疆喀什地区莎车县伊什库里乡榅桲示范园，供试品种为当地大果榅桲，树龄为15年生，树势健壮，土肥管理一致。

榅桲采样落花后10 d(4月20日)，40 d(5月20日)，70 d(6月20日)，100 d(7月20日)，130 d(8月20日)，160 d(9月20日)共6次样。果实采样后冰块保存送至乌鲁木齐实验室-80℃超低温冰箱保存。 表1

表1 榅桲果实发育规律Table 1 Development of quince fruit

植物多糖多酚总RNA提取试剂、盒胶回收试剂盒购自北京天根公司；转录酶M-MLV、高保真DNA聚合酶PrimerSTAR、T4 DNA连接酶均购自大连TAKARA公司；质粒提取试剂盒购自QIAGEN公司；其他试剂均为国产分析纯产品。

1.2 方 法

1.2.1 总RNA提取

取100 mg榅桲果实组织样品在液氮中研碎，按照植物多糖多酚总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，紫外分光光度计测其纯度，OD230/OD260比值为1.75，总RNA经琼脂糖凝胶电泳检测，质量完好的RNA置于-80℃冰箱保存备用。

1.2.2 基因克隆

根据GeneBank数据库中已登录的CAD基因序列，选取以下5个物种进行同源性比对，选择近源物种苹果(XP_028965477.1)、白梨(AKC35072.1)、枇杷(QCH01347.1)、樱桃(XP_021816061.1)、桃(XP_007199637.1)、月季(XP_024165251.1)、胡桃(XP_018827699.1)等5个序列，针对高度同源性区域，分别设计引物PCR扩增。

利用Oligo 6.0软件，设计扩增CAD全长编码区的CAD-CDS引物。以果实组织1 μg总RNA模板，依照反转录酶说明书进行转录合成cDNA，以cDNA为模板，利用高保真酶PrimeStar进行全长编码区扩增，反应体系：2 μL cDNA模板，2.5 μL 5×PS buffer，2 μL dNTP (各2.5 mmol/L)，上下游引物(10 mmol/L)各1 μL，1U Primer Star酶，用双蒸水调整至25 μL。PCR反应条件:94℃ 4 min，94℃ 30 s，60℃ 20 s，72℃ 1.5 min，35个循环，72℃10 min。PCR产物利用DNA胶回收试剂盒进行回收，连接至pMD-19T载体(TAKARA)。由上海生工生物工程技术服务有限公司完成测序。表2

表2 CAD基因克隆引物序列Table 2 Primer sequence for cloning CAD gene

1.2.3 序列分析与结构预测

通过BLAST数据库搜索(www.ncbi.nlm.nih.gov)，初步分析核苷酸序列、氨基酸序列的相似性；将相关物种CAD基因的氨基酸序列下载，在DNAstar软件上进行同源比对；同时用MEGA3.1软件构建系统进化树。

1.2.4 间苯二酚染色

将花后落花后40、70、100、130和160 d(落花后10 d果实不具备染色条件)的榅桲果实从中间部位横切切成2半，放在培养皿中，用1%的间苯三酚溶液和浓盐酸1:1(体积比)的混合液倒入培养皿中浸泡15 min，待榅桲果肉完全显色后拍照，观察果肉木质素的积累程度。

1.2.5 定量PCR检测

Oligo6.0软件设计CAD和内参基因GAPDH定量引物。定量检测引物送交上海生工公司合成。榅桲果实经液氮研磨，通过多糖多纷试剂盒提取总RNA，取1 μg总RNA进行反转录合成cDNA。使用QuantiTect SYBR GreenI试剂(QIAGEN)进行定量PCR检测(Light Cycler 480, Roche)。反应程序：95℃10 min；95℃ 15 s- 58℃ 20 s - 72℃ 20 s，50 cycles；melting curve: 99℃ 0 s- 65℃ 15 s- 99℃ 0.1℃/s；cooling- 40℃, 30 s。 反应体系：2×Master mix 10 μL；primer (10 pM) mix 1 μL；cDNA 2 μL；RNase free water 7 μL。每个样品重复3次。利用2-△△CT法对cDNA中CAD基因的相对表达量进行统计分析。表3

表3 基因定量检测引物序列Table 3 Amplification primers for Quantitative RT-PCR

2 结果与分析

2.1 榅桲CAD基因克隆

研究表明,各物种间CAD基因在中间区域具有高保守性，但是两端保守性较低，特别是5’端差异性较大。以榅桲果实cDNA为模板进行PCR，扩增出一条约1 kb左右的特异性条带。条带清晰，片段大小与预期的相符。图1

PCR产物回收，克隆，经菌落PCR鉴定，对阳性克隆测序。PCR所得的开放阅读框长为1 071 bp，编码356个氨基酸，以ATG为起始密码子，TAG为终止密码子。图2

图1 榅桲CAD基因扩增电泳
Fig.1 Amplification ofCADgene

图2 榅桲CAD基因核苷酸和氨基酸序列
Fig.2CADgene nucleotide and amino sequence

2.2 榅桲CAD基因的同源性比对

研究表明,苹果96.63%，白梨95.79%，枇杷93.26%，月季87.32%，桃92.11%，樱桃91.55%，胡桃87.89%，海岛棉85.92%，亚麻80.00%，桑树83.38%，拟南芥43.59%，烟草83.94%。图3

2.3 榅桲CAD氨基酸组成及进化树

研究表明,榅桲CAD基因编码356个氨基酸。氨基酸残基组成分析显示，Leu(8.99%)、Ala(4.49%)、Thr (5.34%)、Ser(6.46%)、Gly(10.39%)等氨基酸的使用频率较高。表4

榅桲CAD基因与苹果和白梨聚类在一起，与拟南芥进化关系最远。图4

2.4 榅桲果实木质素的积累动态变化

研究表明,榅桲果实从40～100 d，果肉的颜色越来越深，特别是落花后100 d，整个果肉变成了红色，果肉中积累满了木质素，此时木质素积累最多。而榅桲果实发育100～160 d，果肉颜色变淡，木质素积累量逐渐减少。榅桲木质素的积累主要在果肉部分积累，且越靠近果心部位积累越多。榅桲果实木质素的积累主要在发育前期(落花后100 d前)积累完成。图5

注：苹果(XP_028965477.1)、白梨(AKC35072.1)、枇杷(QCH01347.1)、樱桃(XP_021816061.1)、桃(XP_007199637.1)、月季(XP_024165251.1)、胡桃(XP_018827699.1)、海岛棉(PPR83915.1)、亚麻(DAC74029.1)、桑树(XP_010096287.1)、烟草(NP_001312400.1)、拟南芥(NP_177412.1)
Note:apple(XP_028965477.1)、chinese pear(AKC35072.1)、loquat(QCH01347.1)、cherry(XP_021816061.1)、peach(XP_007199637.1)、rose(XP_024165251.1)、walnut(XP_018827699.1)、sea island cotton(PPR83915.1)、flax(DAC74029.1)、mulberry(XP_010096287.1)、tobacco(NP_001312400.1)、arabidopsis thaliana(NP_177412.1)

图3 榅桲CAD基因同源性对比
Fig.3 Homology analysis forCADgene

表4 榅桲CAD基因编码氨基酸的组成Table 4 The composition of amino acids of CAD

注：“target”代表克隆的榅桲CAD基因
Note：“target”representCADin this research

图4 榅桲CAD基因的氨基酸序列比对与进化树
Fig.4 Amino acid sequence allignment and phylogenetic tree analysis

注：红色部分为木质素沉积结果
Note:The result of lignin accumulation in the red part

图5 榅桲果实落花后40、70、100、130和160 d果肉间苯三酚木质素染色结果
Fig.5 Results of lignin staining between pulp 40, 70 , 100 , 130 and 160 days after fruit falling

2.5 榅桲CAD基因在果实发育时期的表达定量

研究表明,在果实发育的6个重要时期，CAD基因的表达在早期阶段表达量较高，其后逐渐下降。10和40 d时的表达量最高，此时木质化程度最大。至70 d时其表达量是10 d时的2/3表达量，至130 d时表达量仅为10 d时的1/5。CAD基因的表达与果实木质化程度高度一致，木质素沉积越小，CAD表达量越低。图6

图6CAD基因在不同时期榅桲果实中的表达
Fig.6 Relative expression ofCADgene

3 讨 论

与苹果、梨等大宗水果相比榅桲果肉高度木质化，但其形成原因一直是空白，研究首次克隆得到了榅桲果实发育过程中调控木质素代谢的关键限速酶基因CAD基因，并采用生物信息学分析的方法探明了该基因的结构。研究中榅桲果肉组织中CAD基因的编码区全序列区采用RT-PCR方法克隆获得，测序得知其编码区全序列由1 071 bp组成。依据序列同源性比对结果表明，该基因在物种间高度保守。榅桲CAD基因编码326个氨基酸，CAD基因C端在不同的物种之间都有高度的结构同源性，N端的同源性较低。

对多物种的CAD基因序列进行同源性分析和系统进化分析，榅桲CAD基因与同为蔷薇科的苹果同源性相似度达96.63%，与白梨相似度达95.79%，聚为一类，而与拟南芥进化关系最远，仅为43.59%的相似度，明确了该实验克隆得到的cDNA序列是榅桲的CAD基因。同时也表明，植物同科之间CAD蛋白的进化过程非常保守，这与尹梅[16]在砀山酥梨上的研究结果一致。

发现了榅桲中CAD基因的表达规律与木质素的沉积密切相关。榅桲果实生长发育缓慢，生育期期长达160 d左右。通过木质素的间苯三酚染色发现，形成榅桲果肉木质化的关键时期在果实发育的前期，果实发育前100 h是木质素沉积的关键时期。而通过CAD的基因表达结果发现，CAD的基因表达量也是伴随着幼果的形成和发育迅速升高，到40 d时达到最高值，以后缓慢降低。研究说明在榅桲果实发育早期，木质素合成快，木质化程度高，CAD基因表达量高。随着木质素沉积速度的趋缓，CAD基因的表达量逐渐降低。CAD基因是调控榅桲果实木质化的关键基因。

4 结 论

榅桲CAD基因其开放阅读框(ORF)序列为1 071 bp，编码356个氨基酸，与其他物种序列同源性最高达96%，进化关系上与苹果较近。榅桲果肉中CAD基因的表达与果实发育木质化程度高度相关，随着木质素合成趋缓呈现一个逐步下调的趋势。CAD基因是调控榅桲果实木质化的关键基因。