王黎霞，黄 芳，张建军，安 健

(1.北京农业职业学院牧医系；北京 102442；2.北京农学院动物科学技术学院，北京 102206)

球虫体外培养对于研究球虫发育、球虫病防治和球虫与宿主的关系具有重大的意义和作用，首先能够更清楚研究球虫细胞内的发育状况[1]；其次可分离到较纯净的抗原，为疫苗的研制打下基础；第三选育弱毒株，为制作弱毒活疫苗提供条件；第四进行新型抗球虫药或是抗球虫药物新剂型研究提供条件[2-3]；第五能够更直观检测球虫与宿主细胞之间的相互作用[4]。更重要的是在科学研究中，体外培养可以减少动物试验，是动物福利实现的重要途径。

球虫体外培养中，不同细胞系对球虫的生长和发育有很大影响。牛肾传代细胞(Madin-Darby bovine kidney，MDBK)是培养E.tenella的良好细胞系[5]，但不适合布氏艾美耳球虫的培养[6]，小隐孢子虫在其中也无法发育[7]。幼地鼠肾细胞(baby hamster kidney，BHK)被用于培养艾美耳属球虫，且认为是优于鸡肾原代细胞和火鸡肾原代细胞[8]。Tierney认为BHK、MDBK、猪肾传代细胞(porcine kidney，PK)-13较适宜培养E.tenella[9]。MDBK和肝母细胞瘤细胞(hepatoblastoma，Hep)-2较适合培养刚地弓形虫，非洲绿猴肾传代细胞(African green monkey kidney，VERO)、BHK、PK-13对于弓形虫的体外培养不是很好[10]。人结肠癌细胞(human colon cancer cell，HCT)-8被认为最适合体外培养小隐孢子虫[11]，有人比较小隐孢子虫入侵狗肾传代细胞(Madin-Darby canine kidney，MDCK)、小鼠星型胶质细胞(Mouse astrocytes，MA)-104、Hep-2和VERO，发现MDCK最易于感染，在MA-104细胞中小隐孢子虫无法进行有性生殖，VERO细胞入侵最少而且无法形成滋养体[12]。也有研究发现兔软骨细胞(Rabbit chondrocytes，VELI)体外培养小隐孢子虫得到卵囊，再次感染小鼠时的毒力更强，说明VELI细胞更适于体外培养小隐孢子虫[13]。弓形虫在宫颈癌细胞(Henrietta Lacks cervical cancer cell，Hela)中培养可以产生大量的速殖子[14]，可见，细胞系对于体外培养寄生虫的影响很大，不同的胞内寄生虫对不同的细胞系的入侵和发育差别很大，所以在体外培养寄生虫时应该广泛选择细胞系。

E.acervulina体外培养过程中，有报道认为早熟减毒株裂殖子在鸡胚成纤维原代细胞(chicken embryo fibroblast，CEF)、鸡肾原代细胞(chicken kidney，CK)中不能发育，而在鸡胚小肠上皮原代细胞可以发育到卵囊阶段[15]。有研究认为E.acervulina入侵鸡胚小肠上皮48 h形成第一代裂殖子，60 h可见大小配子体，72 h可以见到合子[16]。本试验比较MDBK、VERO、PK-15、CEF、CK 5种不同细胞在37 ℃和41 ℃下，子孢子的入侵和发育的情况，以期筛选出适宜E.acervulina体外培养的细胞。

1 材料和方法

1.1 试验材料

虫株：E.acervulina孢子化卵囊，由河北农业大学秦建华馈赠，北京农学院动物科学技术学院病理实验室繁殖并保存。

细胞系：MDBK，由中国农业大学索勋馈赠；VERO、PK-15，由中国农业大学吴清民馈赠。

重要试剂： 改良伊格尔培养基(Dulbecco's modified eagle medium，DMEM)、新生牛血清为Gibico公司产品，青霉素、1∶250胰酶为Orien公司产品，硫酸链霉素为Topbio公司产品，苏木精、伊红为Amersco公司产品。

1.2 方 法

1.2.1 试验材料的纯化和培养E.acervulina子孢子的纯化参考黄芳[17]，CEF培养参考陈淑亚[18]、CK培养参考姜逸[19]、传代细胞系培养参考曾华书[20]。

1.2.2 不同细胞系、不同温度下的E.acervulina子孢子入侵率的比较 用胰酶37 ℃，5%CO2消化3 min，进行细胞计数，调整细胞密度为5×105个/mL。将盖玻片加入6孔板中，每孔加入细胞悬液2 mL，在37 ℃、5%CO2和41 ℃、5%CO2分别培养2 h，显微镜下观察细胞达到融合。将纯化好的子孢子计数，每孔接入105个，再培养24 h，HE染色观察，每个样品观察3个视野，算出平均数，计算入侵率。入侵率=一个视野下被子孢子侵入细胞数/一个视野下细胞数×100%。

1.2.3 不同细胞系、不同温度对入侵时间的影响 按1.2.2方法在37 ℃，5%CO2和41 ℃，5%CO2培养，每隔0.5 h进行HE染色，共观察3 h，观察入侵时间。

1.2.4E.acervulina在MDBK中的发育 按1.2.2方法37 ℃，5%CO2培养，每隔12 h更换1次无血清培养基，每隔2 h进行高碘酸-shiff染色，观察球虫发育情况。

2 结 果

2.1 不同细胞系、不同温度对E. acervulina入侵时间的影响

温度明显可以影响子孢子的入侵时间，子孢子在41 ℃比37 ℃能够较快入侵细胞，37 ℃时子孢子入侵不同细胞系的时间一致，41 ℃时PK-15细胞入侵所需时间较长(表1)。

表1 不同细胞、不同温度下E. acervulina子孢子入侵时间Tab.1 The time of E. acervulina sporozoite invasion five cell at 37 ℃ and 41 ℃

2.2 不同细胞系和温度对E. acervulina入侵率的影响

在37 ℃时，MDBK和PK-15的入侵率显著高于VERO、CEF、CK(P<0.05)，MDBK的入侵率高于PK-15，但二者差异不显著(P>0.05)，VERO、CEF、CK的入侵率差异不显著(P>0.05)，见图1。

41 ℃时，MDBK入侵率最高，但MDBK、PK-15、VERO、CEF的入侵率差异不显著(P>0.05)，CK的入侵率显著低于其他4种细胞(P<0.05)，见图1。

注：A、B、a、b字母不同表示差异显著(P<0.05)，字母相同表示差异不显著(P>0.05)。Note: Different letter is significant difference(P<0.05)，same letter is not significant difference(P>0.05).图1 不同温度、不同细胞系E. acervulina入侵率Fig.1 The invasion rate at different temperature and different cell lines

注：A，入侵前的子孢子(↑)；B，共培养1 h附着于细胞表面的子孢子(↑)；C，2 h后细胞入侵成功(↑)；D，24 h后的子孢子长大，发育为滋养体(↑)；E，52 h的第一代裂殖体(↑)；F，56 h第一代裂殖体发育成熟(↑)；G，H，60 h第一代裂殖子正在释放出细胞(↑)；I，72 h形成第二代裂殖体(↑)。Note: A, The sporozotie before invasion(↑); B, the sporozoite adhere to the cell after co-culture 1 h(↑); C, the sporozoite entered the cell after co-culture 2 h(↑); D, the trophozoite within parasitophorous vacuole after co-culture 24 h(↑); E, the developed schizont after co-culture 52 h(↑); F，the developed schizont after co-culture 56 h(↑); G, H, the merozoite released from cells after co-culture 60 h(↑); I, the second generation schizont formed after co-culture 72 h(↑).图2 E. acervulina MDBK内发育Fig.2 Development of E. acervulina in MDBK

比较温度对入侵率的影响，PK-15和MDBK 37 ℃的入侵率显著高于41 ℃的入侵率， VERO、CEF、CK 41 ℃的入侵率显著高于37 ℃的入侵率，但总体比较MDBK的入侵率无论是在41 ℃还是在37 ℃下培养入侵率都较高，见图1。

2.3 E. acervulina 在MDBK中发育情况

染色后显微镜检查发现，共培养1 h子孢子附着于细胞表面，2 h后子孢子入侵MDBK中，形成带虫空泡。24 h后子孢子转化为早期第一代裂殖体，52 h开始形成第一代裂殖体，56 h形成成熟的第一代裂殖体，60 h第一代裂殖子释放出细胞，72 h形成完整的第二代裂殖体，证明E.acervulina利用MDBK在37 ℃培养可以进行胞内繁殖，见图2。

3 讨 论

细胞对球虫体外培养的影响很大，MDBK是来自牛的细胞系，适宜大部分艾美耳属寄生虫体外培养，但不适合布氏艾美耳球虫和肉孢子虫的培养[6]。HCT-8和MDCK适宜小隐孢子虫的培养[11]，原代牛脐静脉内皮细胞适宜牛艾美耳球虫和祖氏艾美耳球虫的培养[21]，因此，细胞对于体外培养寄生虫的影响十分明显，为了筛选出适宜E.acervulina体外培养的细胞，本试验选择MDBK、PK-15、VERO、CEF和CK 5种细胞进行体外培养对比试验。

41 ℃是鸡的体温，球虫生活在鸡的肠道，41 ℃比较适宜子孢子生长，对比41 ℃和37 ℃对入侵的影响。在三个传代细胞系中，41 ℃都不利于细胞生长，温度改变后细胞基本处于维持状态无法进行繁殖，不适宜体外培养E.acervulina，对于原代细胞41 ℃时只有入侵时间缩短，入侵率并没有优势。原代细胞传代中细胞发育不稳定，一般认为成纤维细胞可以传代20次左右，但是在试验过程中无法保证每次传代的生长效果完全一致，对于下一步的研究有一定的影响。

Naciri-Bontemps用3日龄鸡肾原代细胞体外培养E.acervulina时，在EHT培养基培养44 h可见第一代裂殖体。感染54 h第一代裂殖子释放出细胞。68 h，其入侵周围的细胞并发育成第二代裂殖体。72～96 h，可以观察到第三代和第四代裂殖子。第四代裂殖子可以发育成为配子体，当把收集的配子体感染给鸡45 h可以收获卵囊[22]。E.acervulina子孢子和细胞共培养2 h才侵入细胞，在42 h第一代裂殖体发育完全，56 h才从细胞中释放出来。72 h可见第二代裂殖子发育成熟。这可能与培养基中血清含量有关。有研究证明当培养基成分为90% HBSS、5%乳清蛋白水解物和5%胎牛血清比用95% M199和5%胎牛血清，E.tenella入侵更多[23]。有研究曾比较鸡血清，小牛血清，兔血清和猪血清对鸡原代细胞的生长、子孢子入侵能力以及对E.tenella的第一代和第二代裂殖体的作用效果的影响，发现，鸡血清组子孢子入侵能力最强，胎牛血清组第二代裂殖体比鸡血清多，但鸡血清组的卵囊比胎牛血清多[9]。有研究证明，在无血清培养基中，人隐孢子虫和小隐孢子虫可以发育，并能完成生活史[11]。

MDBK培养E.acervulina可以形成第二代裂殖体，而VERO、PK-15只能发育到第一代裂殖体阶段，CEF和CK中E.acervulina有第一代裂殖子的释放，但未再次入侵，并且CEF和CK不易传代，5种细胞中，MDBK最适宜E.acervulina培养；与MDBK共培养1 h子孢子附着于细胞表面，2 h子孢子入侵，子孢子入侵24 h形成第一代滋养体，52～56 h形成第一代成熟裂殖体，60 h第一代裂殖子释放出细胞，72 h形成第二代裂殖体，在VERO、MDBK、PK-15、CEF及CK这5种细胞中，MDBK是培养E.acervulina的最适宜细胞。