张 帆，陈虹玲，陈锦权，方 婷，潘洁茹

（1.福建农林大学食品科学学院，福建福州 350002；2.福州市疾病预防控制中心，福建福州 350002）

0 引言

鲍鱼作为中国传统名贵食材，位居四大海味之首。自古以来，鲍鱼就有海味珍品之冠的美誉，有“一口鲍鱼一口金”的说法。鲍鱼是软体动物物种之一，属于软体动物门、腹足纲、原始腹足目、鲍科、鲍属[1]。鲍鱼作为当今国内外市场上具有较高的经济价值的海产品之一，是源于其良好的肉质口感和优质的营养价值，被视为海味八珍之首，历年来一直获得大家的好评。近年来，世界鲍鱼产业发展迅速，据统计，2017年全球鲍鱼养殖总产量约为17×104t[2-3]，中国的养殖产量约占全球87%，同时福建地区产量占全国80%以上。随着养殖业和加工业规模的不断扩大，在加工过程中产生了大量废弃物，其中占鲍鱼总质量的15%～25%的内脏等副产物或被直接丢弃或被加工成动物饲料，不仅降低了鲍鱼的利用价值而且对环境造成了一定的污染[4]。通过研究发现，鲍鱼内脏中含有丰富的蛋白质、多糖、牛磺酸和多不饱和脂肪酸等生物活性成分[5]。如果能对这些副产物进行再加工利用，开发成高价值的产品，对保护环境及资源再利用有着重要的意义。

目前，国内外已有很多专家学者开始对鲍鱼内脏进行回收研究利用，研究鲍鱼内脏作为生物活性物质的来源和开发功能性保健食品，如抗氧化肽，抗炎肽和酶解抗血栓保健品[6-8]，提取了鲍鱼内脏多糖并研究了其抗瘤作用和体外抗氧化活性[9-12]。但鲍鱼内脏鱼油的研究还鲜有人涉及。

鲍鱼内脏中富含脂质，人体不能合成的必需氨基酸EPA和DHA含量丰富，EPA（二十碳五烯酸Eicosapentaeonic Acid） 和 DHA（二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic Acid） 属于ω-3系列多不饱和脂肪酸（ω-3 PUFAs）[12]。研究表明，EPA可以降低血脂、胆固醇和软化血管，在预防心脑血管疾病方面也有着突出的作用，DHA是人脑发育的重要组成物质，在改善脑力劳动者的脑记忆和营养补充中有重要作用[13]，如果可以把资源丰富的鲍鱼内脏鱼油应用到食品、药品及保健品等领域，将有广阔的市场前景。

目前，鱼油提取的方法有很多，比较常见的有压榨法、蒸煮法、有机溶剂法、淡碱水解法、酶解法、超临界流体萃取法，其中压榨法的不足之处在于提取率低，因此在鱼油提取中很少采用[14]。蒸煮法提取时高温提取易导致鱼油中的营养物质遭到破坏，导致提取的鱼油品质较差[15]。淡碱水解法由于废液中钠盐含量高不利于环境保护。利用氨水和铵盐替代氢氧化钠和氯化钠的氨法具有废液回收再利用生产肥料的优点，但氨水的强挥发性限制了其大规模的应用[16]。超临界流体萃取法生产成本高，无法应用到产业化生产中[17-18]，酶解法通过利用酶的特异水解特性，筛选适宜的蛋白酶水解物料中蛋白质和脂肪的结合位点，使油脂释放出来。此方法的提取条件相对宽松温和，无污染，提取率高，很好地提高了资源的利用率。同时，还可以回收利用蛋白酶水解液中的多肽和氨基酸等功能物质[19-21]。为了进一步提高酶解法对鱼油的提取率，将有机溶剂法和酶解法结合在一起使用，旨在为水产加工副产物的活性成分提取提供理论依据。以正己烷-异丙醇（3∶2） 作提取剂辅助酶解法提取鲍鱼内脏鱼油，探究提取鲍鱼内脏鱼油的最佳工艺，为鲍鱼副产物的综合开发利用提供基础数据和理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲍鱼内脏，诏安海联食品有限公司提供；胃蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶，丹麦诺维信公司提供；正己烷（分析纯）、异丙醇（分析纯）等，国药集团化学试剂有限公司提供。

1.2 仪器与设备

DJ1-0.12型小型单道打浆机，江苏科威机械有限公司产品；JMS-80型胶体磨，温州市互丰机械有限公司产品；DZF6050型真空干燥箱，上海精宏实验设备有限公司产品；DHG-9240A型电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司产品；THZ-C型恒温振荡器，太仓市实验设备厂产品；RE-52AA型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂产品；DD5型台式低速离心机，长沙英泰仪器有限公司产品；PHS-3C型pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司产品；CP214型电子天平，奥豪斯仪器（常州） 有限公司产品；FREEN-Q1-10T型纯水机，南京易普易达科技发展有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 原料预处理

取出存放在-20℃下保存的鲍鱼内脏，加入适量清水解冻清洗，待内脏解冻完毕后立即将其胃部剪去，去除胃内鲍鱼摄入的海藻等干扰物和胃酸对后续鱼油提取的影响，然后用打浆机绞碎，最后经胶体磨均质后备用。

1.3.2 鲍鱼内脏鱼油提取工艺

将预处理后的鲍鱼内脏按一定的比例与蒸馏水混匀，添加缓冲溶液调节pH值（利用一定浓度的HCl或NaOH溶液调节pH值），加入蛋白酶进行酶解，酶解结束后于沸水浴中灭酶15 min，再加入90 mL的体积比为3∶2的正己烷-异丙醇作萃取剂，然后将其置于振荡频率为250 r/min下的恒温振荡器中振荡萃取30 min。萃取结束后静置分层，取其上层清液，减压干燥除去萃取剂，放入80℃的真空干燥箱中，将料液干燥至恒质量，得到鲍鱼内脏鱼油。

1.3.3 鱼油提取率的计算

1.3.4 最适酶的选择

以鲍鱼内脏鱼油提取率为评价指标，根据表1中所示的5种酶的最适酶解pH值、最适酶解温度、最适酶添加量、最适酶解时间的条件下加入相应的蛋白酶对鲍鱼内脏进行酶解，考查下列5种蛋白酶的鲍鱼内脏鱼油的提取效果，选择最适酶。

5种酶的最佳酶解条件对照见表1。

表1 5种酶的最佳酶解条件对照

1.3.5 单因素试验

（1） 料液比。在5个250 mL的锥形瓶中分别放入5 g预处理后的鲍鱼内脏并编号。分别按鲍鱼内脏∶蒸馏水为1∶0.5，1∶1，1∶1.5，1∶2，1∶2.5的比例加入蒸馏水搅匀。加入缓冲液将pH值调至7.0，之后加入酶添加量为1.5%的木瓜蛋白酶，将其置于55℃水浴中酶解3 h。酶解结束后，将其置入沸水浴中灭酶15 min，再加入90 mL的体积比为3∶2的正己烷-异丙醇作萃取剂，于振荡频率250 r/min下振荡萃取30 min。萃取结束后待其静置分层，取其上层清液，减压干燥除去萃取剂，放入80℃的真空干燥箱中将料液干燥至恒质量。计算各组的鱼油提取率并确定最合适的料液比。

（2） 酶解温度。在5个250 mL的锥形瓶中分别放入5 g预处理后的鲍鱼内脏并编号。分别按照鲍鱼内脏∶蒸馏水为1∶1的比例加入蒸馏水搅匀，加入缓冲液调节pH值至7.0。之后加入酶添加量为1.5%的木瓜蛋白酶，将其置于恒温水浴锅中酶解3 h，水浴温度分别为35，45，55，65，75℃。酶解结束后将其置入沸水浴中灭酶15 min。再加入90 mL的体积比为3∶2的正己烷-异丙醇作萃取剂，然后将其置于振荡频率为250 r/min下的恒温振荡器中振荡萃取30 min。萃取结束后待其静置分层，取其上层清液，减压干燥除去萃取剂，放入80℃的真空干燥箱中将料液干燥至恒质量。计算各组的鱼油的提取率并确定最佳酶解温度。

（3） 酶解时间。在5个250 mL的锥形瓶中分别放入5 g预处理后的鲍鱼内脏并编号。分别按鲍鱼内脏∶蒸馏水为1∶1的比例加入蒸馏水搅匀，加入缓冲液将pH值调至7.0。之后加入酶添加量为1.5%的木瓜蛋白酶，将其置于55℃水浴中，各组的酶解时间分别为2，3，4，5，6 h。酶解结束后于沸水浴中灭酶15 min，再加入90 mL的体积比为3∶2的正己烷-异丙醇作萃取剂，然后将其置于振荡频率为250 r/min下的恒温振荡器中振荡萃取30 min。萃取结束后待其静置分层，取其上层清液，减压干燥除去萃取剂，放入80℃的真空干燥箱中将料液干燥至恒质量。计算各组的鱼油提取率并确定最佳酶解时间。

（4） 酶解pH值。在5个250 mL的锥形瓶中分别放入5 g预处理后的鲍鱼内脏并编号。分别按鲍鱼内脏∶蒸馏水为1∶1的比例加入蒸馏水搅匀。分别加入pH值缓冲液调节各组的pH值，分别为5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，之后加入酶添加量为1.5%的木瓜蛋白酶，将其置于55℃水浴中酶解3 h。酶解结束后于沸水浴中灭酶15 min。再加入90 mL的体积比为3∶2的正己烷-异丙醇作萃取剂，于振荡频率250 r/min下振荡萃取30 min。萃取结束后待其静置分层，取其上层清液，减压干燥除去萃取剂，放入80℃的真空干燥箱中将料液干燥至恒质量。计算各组的鱼油提取率并确定最佳酶解pH值。

（5）酶添加量。在5个250 mL的锥形瓶中分别放入5 g预处理后的鲍鱼内脏并编号。分别按鲍鱼内脏∶蒸馏水为1∶1的比例加入蒸馏水搅匀，加入缓冲液将pH值调至7.0。之后加入木瓜蛋白酶，其中的酶添加量分别为0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，将其置于55℃水浴中酶解3 h。酶解结束后于沸水浴灭酶15 min，再加入90 mL的正己烷-异丙醇（3∶2） 作萃取剂，于振荡频率为250 r/min下振荡萃取30 min。萃取结束后待其静置分层，取其上层清液，减压干燥除去萃取剂，放入80℃的真空干燥箱中将料液干燥至恒质量。计算各组的鱼油提取率并确定最佳酶添加量。

1.3.5 试验设计

在单因素试验结果的基础上，选择主要的影响因素进行正交试验设计，选取L9（34）正交表，确定最佳的鱼油提取工艺方案。所得的试验数据采用Microsoft Excel，SPSS16.0软件进行处理及分析。

2 结果与分析

2.1 最适酶的选择

按照5种蛋白酶在最适酶解条件下酶解预处理鲍鱼内脏后，测定各组蛋白酶酶解后的鲍鱼内脏鱼油的提取率。

不同蛋白酶对鲍鱼内脏的酶解效果见图1。

由图1可知，在最适酶解条件下，不同种类的蛋白酶对鲍鱼内脏中蛋白质和其他成分的酶解程度不同，从而影响鲍鱼内脏油成分的释放效果，对后续的正己烷-异丙醇萃取鲍鱼内脏鱼油也产生了影响。其中在木瓜蛋白酶酶解后，从鲍鱼内脏中的鱼油提取率最高为18.44%；而且物料的pH值也接近中性，故确定木瓜蛋白酶为最佳酶解蛋白酶。

2.2 单因素试验

图1 不同蛋白酶对鲍鱼内脏的酶解效果

图3 酶解温度对鲍鱼内脏鱼油提取率的影响

2.2.1 料液比对鲍鱼内脏鱼油提取率的影响

料液比对鲍鱼内脏鱼油提取率的影响见图2。

由图2可知，当料液比为1∶1比例范围内时，提高料液比的比例能较大地提升鲍鱼内脏鱼油的提取率，当料液比为1∶1时提取率达到了最大值，为18.09%。当超过该临界料液比时，料液比的扩大反而使鲍鱼内脏鱼油的提取率降低。出现该结果的原因可能是由于在该临界的料液比条件下，已达到了最大的料液浓度平衡，料液比扩大导致水添加量过多，降低了木瓜蛋白酶的浓度，从而降低酶解的速率，导致鱼油提取速率下降，并且木瓜蛋白酶可能会酶解鲍鱼内脏中的鱼油成分，从而提取的鱼油量逐渐减少。随着料液比的不断扩大，鱼油的提取速率趋于平缓，并且没有明显的变化。可能的原因是当达到一定的料液比时，物料中的蛋白质和其他成分基本已经被水解，使得整个体系到了浓度平衡，所以鱼油的提取率基本不变。因此，当料液比为1∶1时，为提取鲍鱼内脏鱼油的最佳料液比。

2.2.2 酶解温度对鲍鱼内脏鱼油提取率的影响

酶解温度对鲍鱼内脏鱼油提取率的影响见图3。

由图3可知，随着温度的升高，鲍鱼内脏鱼油的提取率呈现先升后降的趋势。酶解温度为45℃时，鲍鱼内脏鱼油的提取率最高，达到18.68%。主要原因是温度对木瓜蛋白酶的活性有重要影响。随着温度的升高，酶的活性逐渐增加，反应速率随温度的升高而增加，从而导致鲍鱼内脏鱼油提取率的增加；但是酶本身是蛋白质，温度继续升高会使其本身变性从而失活，酶解能力也随之下降，影响了油脂的释放程度，从而使鲍鱼内脏鱼油的提取率下降。因此，当酶解温度为45℃时，是提取鲍鱼内脏鱼油的最佳酶解温度。

2.2.3 酶解时间对鲍鱼内脏鱼油提取率的影响

酶解时间对鲍鱼内脏鱼油提取率的影响见图4。

由图4可知，鲍鱼内脏鱼油的提取率随时间先增加，然后下降到平坦的趋势。当酶促水解时间为3 h时，油的提取率达到最大值17.73%。可能的原因是随着酶水解时间的增加，木瓜蛋白酶将持续水解鲍鱼内脏中的蛋白质和其他物质，使得鲍鱼内脏中的油脂成分释放速度增加，鲍鱼内脏鱼油提取率随之增大；但是随着酶解时间的继续增加，鲍鱼内脏中的油脂成分可能会被木瓜蛋白酶酶解；当酶解时间大于5 h时，酶的酶解能力已达到饱和，物料中的溶质基本被溶剂所提取出来，达到了整个体系的浓度平衡。因此当酶解时间为3 h时，是提取鲍鱼内脏鱼油的最佳酶解时间。

2.2.4 酶解pH值对鲍鱼内脏鱼油提取率的影响

酶解pH值对鲍鱼内脏鱼油提取率的影响见图5。

由图5可知，鲍鱼内脏鱼油随着pH值的增长呈现出了先增长后下降的趋势，且当酶解pH值为7时，达到了木瓜蛋白酶最适酶解温度，同时鲍鱼内脏鱼油的提取率达到了最大值，为18.91%。可能的原因是随着pH值的增加，逐渐达到了木瓜蛋白酶的最适酶解温度，所以其酶解活力逐渐增强，反应速率也随之增快，鲍鱼内脏鱼油的提取率增加；但是当酶解pH值继续增加，超过了木瓜蛋白酶的最适pH值后，木瓜蛋白酶逐渐因变性而失活，使得鲍鱼内脏中蛋白质等物质分离的速度下降，影响了鲍鱼内脏鱼油的提取。综上所述，当酶解pH值为7时，是提取鲍鱼内脏鱼油的最佳pH值。

图5 酶解pH值对鲍鱼内脏鱼油提取率的影响

2.2.5 酶添加量对鲍鱼内脏鱼油提取率的影响

酶添加量对鲍鱼内脏鱼油提取率的影响见图6。

图6 酶添加量对鲍鱼内脏鱼油提取率的影响

由图6可知，鲍鱼内脏鱼油的提取率随着酶添加量从0.5%到1.5%迅速增加，且当酶添加量达到1.5%时，油脂的提取率达到最大值，为18.86%；但是随着酶添加量继续增加，鲍鱼内脏鱼油的提取率出现显著的下降趋势。可能原因是随着酶添加量的增加，料液中酶浓度增加，蛋白酶会更加充分地酶解鲍鱼内脏中的蛋白质和其他成分，有利于油脂成分的释放，从而使鲍鱼内脏鱼油提取率增加；但是随着酶添加量继续增加，料液的物料浓度太高导致溶液变稠，使得油脂不能很好地与蛋白质等物质分离，且过多的木瓜蛋白酶还会酶解鲍鱼内脏中的鱼油，反而不利于鱼油的提取。综上所述，当酶添加量为1.5%时，是提取鲍鱼内脏鱼油的最佳酶添加量。

2.3 正交试验优化结果与分析

在单因素试验的结果上，利用正交分析对鲍鱼内脏鱼油的提取工艺进行优化。单因素试验结果表明，鲍鱼内脏鱼油的提取率在料液比和pH值分别达到1∶1和7时，在这两种影响因子的作用下，油脂的提取率处于相对稳定的水平。因此，选择酶解温度，酶添加量和酶解时间作为工艺优化的研究对象，参考指标为鲍鱼内脏鱼油的提取率。选用L9（34）表进行正交试验，以确定提取油的最佳工艺条件。

正交试验因素与水平设计见表2，正交试验结果及分析见表3，正交试验方差分析见表4。

表2 正交试验因素与水平设计

表3 正交试验结果及分析

表4 正交试验方差分析

由表3可知，影响鲍鱼内脏鱼油提取率的因素依次为A＞B＞C，即酶解温度＞酶添加量＞酶解时间，最佳方案为A2B2C3。从表4的正交方差分析结果可以看出，酶解温度的方差值大于F0.01(2,2)，说明其对鲍鱼内脏鱼油的提取率具有极显著的效果，酶添加量因素的方差值介于F0.05(2,2)和 F0.01(2,2)之间对鲍鱼内脏鱼油的提取率有显著影响（0.01＜p＜0.05），而酶解时间没有显著影响 （p＞0.05）。

综上所述，在料液比1∶1，酶解温度55℃，酶添加量1.5%，酶解时间4 h，酶解pH值为7时是鲍鱼内脏鱼油的最佳提取工艺。在此条件下，鲍鱼内脏鱼油的提取率达到了18.93%，符合第5组的各因素组合。

3 结论

以鲍鱼内脏为研究对象，用5种不同的蛋白酶对鲍鱼内脏中鱼油进行酶解提取，选择最适的酶，再利用有机溶剂辅助酶解提取，以提高鱼油提取率。结果表明，木瓜蛋白酶的提取率最高达到了18.44%，在单因素试验的基础上，通过正交试验优化得到最佳提取工艺为料液比1∶1，酶解温度55℃，酶添加量1.5%，酶解时间4 h，pH值7，其油脂的提取率最高为18.93%。在此条件下鲍鱼内脏鱼油提取率较高，品质较好，研究结果将为鲍鱼副产物的综合利用提供一定的理论支持和指导。