何冰倩，程桂林，李桂东，王剑峰∗

（1.浙江中医药大学中医药科学院，浙江 杭州 311404；2.杭州胡庆余堂第二门诊部，浙江 杭州 310002）

中医药作为中华民族的瑰宝，不仅含有目前偏重研究的有机化合物，同时也含有经常被忽视的Fe、Mn、Cu、Zn、Se、B、Sr 等多种微量元素。中药中微量元素是决定中药四性的物质基础之一，也是中药有效成分的核心组分［1］。目前随着对其微量元素的深入研究，不断发现某些中药中的微量元素与其疗效存在一定的相关性，如微量元素的种类及含有量［2-4］。

中药体外预消化可定义为单味中药材或中药复方通过煎煮、浓缩、发酵、赋型（喷雾干燥或冷冻干燥）在体外完成模仿体内消化之全过程。通过模拟人体的胃肠环境，结合物理消化和生物消化，将不易消化吸收或有毒中药在人体外进行预消化，从而增加中药的疗效、降低毒性，利于临床使用。软坚散结类中药常用于肿瘤治疗，特别是一些介壳和矿石类中药，这类中药的传统炮制法多为高温煅烧或是采用醋淬法，经高温煅烧后，中药中的蛋白或者多糖类成分发生变性，含有量大大降低，而其所含的微量元素大多比较稳定，这些微量元素很可能是中药发挥软坚散结作用的物质基础。

大部分中药均以水煎液的形式供患者服用。介壳类中药中微量元素的存在形态，以及其溶出率高低受复方配伍及酸度的影响较大［2］。介壳类中药大多具有平肝潜阳的功效，部分还具有滋阴潜阳、重镇降逆、软坚散结、镇心安神等功效。牡蛎、瓦楞子、蟹壳和鳖甲均具有软坚散结的作用，研究表明，其治疗甲状腺结节、甲状腺肿瘤等相关疾病效果显著［5-8］。本研究拟对牡蛎、瓦楞子、蟹壳及鳖甲4 种介壳类中药，通过采用不同的体外预消化方式，提取中药中的微量元素，并对其进行分析检测，考察体外预消化方式对微量元素提取效率的差异，以期为提高中药的疗效及质量控制提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器 iCAP 7000 SERIES 电感耦合等离子发射光谱仪（美国赛默飞世尔科技公司）；DGG-9240 型电热恒温鼓风干燥箱（上海森信实验仪器有限公司）；Allegra X-30 Centrifuge 多功能台式高速离心机（美国贝克曼库尔特公司）；Milli-Q Direct 8 纯水仪（默克密理博公司）；MC-100B 恒温摇床（上海牟测仪器科技有限公司）；Mettler MS204TS 精密天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）；Scientific 1300 系列A2 型二级生物安全柜（美国赛默飞世尔科技公司）；S210-K pH 计（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）。

1.2 材料 牡蛎、瓦楞子（批号170202，170103）购于安徽亳州中药材市场；蟹壳、鳖甲（批号 161201，161102）购于安徽庆丰堂。药材经浙江中医药大学药学院黄真教授鉴定，牡蛎为牡蛎科动物近江牡蛎Ostrea rivularisGould 的贝壳；瓦楞子为蚶科动物毛蚶Arca subcrenataLischke 的贝壳；蟹壳为为弓蟹科动物中华绒螯蟹Eriocheir sinensisH.Milne-Edwards 的甲壳；鳖甲为鳖科动物鳖Trionyx sinensisWiegmann 的背甲。双鱼牌9°米醋（杭州市食品酿造有限公司，批号20170531）；保加利亚乳杆菌CICC6032（上海北诺生物科技有限公司）；牛肉膏（上海麦克林生化科技有限公司，批号C10086453）；酪蛋白胨（青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，批号20161012）；无水葡萄糖（上海凌峰化学试剂有限公司，批号20160615）；酵母粉［生工生物工程（上海）股份有限公司，批号CC29BA0010］。柠檬酸氢二铵（上海凌峰化学试剂有限公司，批号20151216）；优级纯硝酸（批号20131011）、吐温80（批号20160627）、无水乙酸钠（批号20170227）、无水磷酸氢二钾（批号20161112），均购于上海凌峰化学试剂有限公司，七水硫酸镁（上海沪试实验室器材股份有限公司，批号20170426）；一水合物硫酸锰（上海麦克林生化科技有限公司，批号C10086124）；As、Be、Ca、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、Mg、Mn、Mo、Ni、Pb、Sb、Se、Ti、V、Zn 对照品溶液（国家有色金属及电子材料分析测试中心，1 000 μg/mL，16DC341）。

2 方法

2.1 样品醋提取法 精密称取各药材粉末（50 目筛）20 g，分别加入0%（蒸馏水）、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50% 体积分数的米醋至60 mL，加热回流1 h 后，12 000 r/min 离心15 min 后取上清液，过滤后加超纯水定容至100 mL，备用。

另用传统醋淬法制备样品，取20 g 各药材粉末置于坩埚中，酒精灯加热煅烧并翻炒至微黄，立即加入米醋20 mL醋淬，将所有物料转移至圆底烧瓶中，加超纯水40 mL，同法制备，备用。

2.2 生物发酵提取法

2.2.1 MRS 培养基［9］酪蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母粉5.0 g、无水葡萄糖20.0 g、柠檬酸氢二铵2.0 g、无水乙酸钠5.0 g、无水磷酸氢二钾2.0 g、七水硫酸镁0.25 g、一水合物硫酸锰0.58 g、吐温80 1 mL，以超纯水定容到1 000 mL，pH 6.2～6.4，121 ℃条件下高压灭菌20 min。

2.2.2 菌种活化［10］取保加利亚乳杆菌的甘油冻干管，接入新配灭菌的MRS 液体培养基中，在37 ℃，80 r/min条件下摇床震荡活化培养24 h。后再以10%接菌量转接至新配灭菌的MRS 液体培养基中，在37 ℃，80 r/min 条件下摇床震荡活化培养24 h，得到发酵所需的保加利亚乳杆菌的液体菌种。

2.2.3 生物发酵［11］取牡蛎、瓦楞子、蟹壳、鳖甲各5 g，各加入发酵所用的保加利亚乳杆菌菌种液15 mL，在40 ℃，80 r/min 条件下摇床震荡活化培养96 h。

2.2.4 生物发酵供试品溶液制备 将含有5 g 药材的发酵液，离心过滤除去残渣，滤液用超纯水定容至100 mL，备用。

2.2.5 生物发酵空白对照品溶液制备 将15 mL 发酵96 h的发酵液，离心过滤除去残渣，滤液定容至100 mL，备用。

2.3 条件 射频功率1 150 W；雾化器气体流量0.70 L/min；冷却气体积流量12 L/min；辅助气体积流量0.5 L/min；分析泵速50 r/min，冲洗泵速100 r/min；积分时间长波长5 s，短波长15 s；样品测定次数3 次；样品冲洗时间30 s；等离子观测方式为垂直观测。

2.4 线性关系考察 取各元素的对照品液适量，加10%硝酸水溶液稀释，制备一系列的混合对照品溶液，各元素的质量浓度分别为0、1、2、5、10、50 μg/mL。分别吸取各混合对照品溶液，依法测定不同体积分数的米醋配制的空白溶液及生物发酵空白溶液和系列对照品溶液，以吸光度为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X），进行回归，得各元素对照品曲线方程及线性相关系数。平行测定空白样品溶液20 次，依照IUPAC 的方法计算检测下限，得各待测元素的检出限，结果见表1。表明各元素在各自范围内线性关系良好。

表1 各元素线性关系

3 结果与分析

分别按“2.1”“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项条件下进行测定，扣除空白溶液及生物发酵空白溶液所得结果后，得各样品在各制备方法下元素的量。结果显示20%米醋对样品进行提取后，各元素提取总效率最高，故主要对纯水、20%米醋、生物发酵法及传统的醋淬后水提法作为体外预消化方式提取后的结果进行分析。结果见图1、表2。

图1 各元素含有量测定结果分析图

当用不同体积分数米醋对样品中Fe、Mn、Sr 及Zn 进行提取时，所得结果为随着米醋体积分数升高，各样品中4 种元素含有量均有不同程度的升高，且有趋于稳定的趋势，见图2。除鳖甲样品外，其余样品中Fe 含有量均会在某一米醋体积分数时达到峰值。生物发酵法提取后4 种介壳类药物中Mn 含有量最高，Zn 含有量最低，米醋对各样品中Sr 的提取效率提高最显著，且各样品中各元素的提取效率为生物发酵法优于20%米醋提优于水提。另醋淬法炮制各样品后，4 种元素的提取效率亦无生物发酵法提取效率高。

4 讨论

图2 不同体积分数米醋提取各样品中各元素结果分析图

本实验采用ICP-OES 法测定介壳类药物牡蛎、瓦楞子、蟹壳及鳖甲样品经不同体外预消化方式提取后的微量元素Fe、Mn、Sr 及Zn 的含有量。实验分析的元素包括Ba、Ca、Co、Cu、K、Li、Mg、Na、Ni、Se 等，但是因某些元素已有文献表明研究较多或未在样品中检出或低于检出限，且已有研究表明Fe、Mn、Sr、Zn 与治疗甲状腺疾病疗效相关性较强［12-15］，故筛选了4 种元素进行测定。

表2 各元素含有量测定结果

4 种样品经不同体外预消化方式提取后的各元素含有量差异较大，而传统的醋淬法炮制4 种样品并没有增加4种微量元素的提取率。生物发酵法可提高4 种样品中4 种微量元素的提取效率，其中Sr 在4 种介壳类药物中提取的含有量均较高。另4 种样品中提取Fe 的效率也对生物发酵法具有较强的依赖性，且3 种样品在不同体积分数米醋提取时可达到峰值，推测米醋会与样品发生反应从而有助于对Fe 的提取，但当米醋达到一定比例时又与铁离子发生络合而形成沉淀，导致提取液中Fe 含有量降低。

综上所述，介壳类药物中含有丰富的人体必需的微量元素，其可能在药物药效发挥的过程中存在一定的协同作用［16］。《中国药典》 中仅以碳酸钙的含有量作为介壳类药物的质量评价指标，较难反映出各药材样品间的区别，且难以对该类药物的效应物质基础进行深入的研究。故本研究通过对不同体外预消化方式提取4 种介壳类药物中的Fe、Mn、Sr 及Zn 含有量分析及比较可知，各种方式提取的介壳类药物中的微量元素含有量差异较大，且生物发酵的体外预消化方式对提高各元素的提取效率具有一定的促进作用，其效果比20%米醋提取效果更佳。体外预消化可通过改变中药提取液的种类及提取方式，增加各样品中某些微量元素的提取效率。另外，生物发酵还可分解中药汤剂中的多糖、苷类及某些多肽类物质，分解成的小分子物质更易被机体吸收及利用，如单糖、氨基酸等，从而有效地提高药物疗效［17］，以期为中草药配制工艺的探讨、传统药理的阐明、活性物质的揭示等提供参考，为微量元素与生理机能在分子水平上的研究奠定基础。