廖 林， 吕淑霞， 张云鹤， 姚 硕， 张 良， 马 镝， 林 英， 于晓丹

（沈阳农业大学 生物科学技术学院，辽宁 沈阳110866）

维生素C（VC）是一种重要的人体必需维生素，在医药、食品、饲料、化妆品等领域广泛应用。 混菌发酵转化L-山梨糖为2-酮基-L-古龙酸（2-KGA）是二步发酵法[1]生产VC 工艺的核心过程。早期报道的VC 混菌发酵体系是由氧化葡萄糖酸杆菌（G.oxydans）和条纹假单胞杆菌（P. striata）组成[2]。 其中，氧化葡萄糖酸杆菌为产酸菌， 条纹假单胞杆菌为伴生菌。Urbance 等[3]对产酸菌进行表型和基因型分析后，将其归类为一个新的Ketogulonigenium属，vulgare种，即普通生酮基古龙酸杆菌（K. vulgare，K.v）。 目前，工业上生产VC 常用的伴生菌主要为原核微生物中的芽孢杆菌属，如巨大芽孢杆菌（B. megaterium）、苏云金芽孢杆菌（B. thuringiensis）和蜡样芽孢杆菌（B. cereus）[4]等，而用真核微生物作为伴生菌却鲜有报道。 作者所在实验室筛选到1 株能高效促进K. vulgare产2-KGA 的真核微生物——胶红酵母（R.mucilaginosa）。 由于现有的发酵培养基是以某些芽孢杆菌作为伴生菌，其营养成分可能无法满足胶红酵母（R.m）与产酸菌（K.v）组成新菌系的生长与产酸。 因此，作者采用响应面法对现有VC 混菌发酵培养基成分进行优化，以充分发挥新菌系发酵潜力，最终提高2-KGA 的产量。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

1.1.1 试验材料 土样： 沈阳东陵龙尾湖淤泥；菌种：普通生酮基古龙酸菌（K. vulgare），作者所在实验室保存。

1.1.2 主要仪器设备 万分之一电子天平：赛多利斯科学仪器北京有限公司；LDZX-30KBS 立式压力蒸汽灭菌器： 上海申安医疗器械厂；HPS-160 生化培养箱： 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；HZQ-C 空气浴振荡器：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；BH-2 显微镜：OLYMPUS；ST2100 pH 计：奥豪斯仪器常州有限公司；JW-2017HR 高速冷冻离心机： 安徽嘉文仪器装备有限公司；S1000TMThermal Cycler：BIO-RAD；Universal Hood Ⅱ凝胶成像系统：BIO-RAD；DL-CJ-2ND-Ⅱ洁净工作台：北京东联哈尔滨仪器有限公司；JY600C 电泳仪： 北京君意东方电泳设备有限公司。

1.1.3 培养基 基础发酵培养基（g/L）：L-山梨糖80，玉米浆15， 尿素12，KH2PO41，MgSO40.2，CaCO35；pH 6.7～7.0。

种子培养基（g/L）：L-山梨糖20，葡萄糖2，尿素1，玉米浆5，CaCO31；pH 6.7～7.0。

YPD 培养基：酵母膏1 g/dL，蛋白胨2 g/dL，葡萄糖2 g/dL。 制备固体培养基，加入2 g/dL 琼脂粉。

培养基所用试剂均为分析纯， 配制时均以1 mol/L NaOH （HCl） 调节pH 为6.7， 然后再加入CaCO3搅拌均匀，L-山梨糖单独在121 ℃灭菌25 min。

1.2 试验方法

1.2.1 目标伴生菌的富集培养 取约5 g 淤泥，放入盛有50 mL 无菌水的150 mL 三角瓶中， 振荡30 min，将泥土上的微生物分散在无菌水中，4 ℃静置1 h后，取100 μL 涂布在YPD固体平板培养基上，28 ℃恒温倒置培养2～3 d，从中挑选表面光滑的菌落（目标伴生菌）， 于新的YPD 固体平板培养基上划线培养， 从长出的单菌落上挑取一环接种于装有20 mL YPD 液体培养基的250 mL 三角瓶中，180 r/min、28℃培养24 h，得到待选的目标伴生菌的菌悬液。

1.2.2 目标伴生菌与产酸菌的混合发酵培养 取2 mL经种子培养基活化的产酸菌K. vulgare，接种于装有20 mL 发酵培养基的250 mL 三角瓶中， 同时接入0.5 mL 目标伴生菌的菌悬液，180 r/min、28 ℃混菌发酵培养96 h 达到终点。

1.2.3 绘制目标伴生菌的菌株生长曲线 用YPD固体培养基对目标伴生菌菌株进行活化培养24 h后，10%接种于20 mL YPD 液体培养基的250 mL三角瓶中，28 ℃、180 r/min 恒温振荡培养， 每3 小时取样1 mL 培养液，4 000 r/min 离心5 min， 取沉淀，加1 mL 蒸馏水洗涤，4 000 r/min 离心5 min，取沉淀，加1 mL 蒸馏水混匀后，取样稀释，650 nm 波长下测OD 值，以蒸馏水为对照。 另以时间为横坐标，OD650值为纵坐标，绘制目标伴生菌菌株生长曲线。

1.2.4 2-酮基-L-古龙酸测定 采用碘量法测定[6]。

1.2.5 菌株初步鉴定 目标伴生菌的初步鉴定主要对照真菌鉴定手册[7]，依据菌株的菌落形态和个体形态特征进行归类与鉴定。

1.2.6 菌株分子鉴定 形态学鉴定是传统的方法，为确保鉴定的准确性， 需结合分子鉴定。 利用ITS（Internal Transcribed Spacer） 序列进行菌种鉴定是目前较多采用的方法。 ITS 序列位于rRNA 编码基因18 S、5.8 S 和28 S 之间的小基因片段，具有高拷贝数， 整个序列的长度范围在600～800 bp， 利用rDNA 通用引物能够很容易被扩增出来。因此，rDNA在微生物的鉴定应用中，具有检测微生物种水平的多态性特征。

取目标伴生菌的菌悬液，按照文献[8]的方法提取基因组DNA。 PCR 引物为ITS4/ITS5，ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；ITS5：5’-GGAAG TAAAAGTCGTAACAAGG-3’ 由上海生工生物工程有限公司合成。PCR 扩增DNA，反应体系为20 μL：MIX 混合液10 μL，引物各1 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 6 μL。 PCR 反应程序为：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性35 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸1 min，30个循环，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。回收PCR 产物并测序，以BLAST 程序进行DNA 序列比对。

1.2.7 响应面试验设计

1）单因素试验：以基础发酵培养基中各个成分为试验因素，通过固定其它成分因素不变，每次只研究一个变化因素来进行单因素试验。 以基础发酵培养基中各个成分的不同添加量为试验水平， 以2-KGA产量为试验指标，设计得到6 因素5 水平的因素水平表，见表1。

表1 单因素试验因素与水平Table 1 Factors and levels in single factor test

2）响应面试验：在单因素试验的基础上，借助Design Expert 8.0.6 软件，采用Box-Behnken Design（BBD）[9-10]设计原理，选取L-山梨糖、尿素、玉米浆、CaCO3、MgSO4、KH2PO4添 加 量 为 试 验 因 素， 以2-KGA 产量为指标，进行响应面分析，得到6 因素3水平编码表，见表2。

表2 试验因素水平及编码Table 2 Factors, levels and codes of response surface tests

3）响应面模型验证试验：以响应面试验优化后的培养基条件进行VC 混菌发酵，重复3 次，所得平均值与系统预测值越接近则模型越可靠。

2 结果与分析

2.1 菌株的形态特征

按照1.2.1 中的方法， 筛选得到一株能够作为K. vulgare伴生菌的菌株，将其命名为A8，以进行后续实验。

分离纯化后得到的菌株A8， 在YPD 固体平板培养基上划线和涂布培养3 d。 通过菌落形态特征可知，菌株A8 呈粉红色，菌落直径大小为4～6 mm，边沿整齐，表面光滑、湿润、发亮、呈奶酪状，生长较快，质地细腻柔软，见图1。在显微镜下观察菌株A8 的细胞呈椭圆形，以出芽方式进行无性繁殖，见图2。 经形态特征初步鉴定，菌株A8 属于酵母菌类。

图1 菌株A8 的菌落形态Fig. 1 Colony morphology of strain A8

图2 菌株A8 的细胞形态Fig. 2 Cell morphology of strain A8

2.2 菌株的分子鉴定

为进一步鉴定菌株A8，以其基因组DNA 为模板，利用真菌ITS rDNA 通用引物ITS4/ITS5 进行PCR 扩增，电泳检测得到长度约为750 bp 的PCR扩增产物，见图3。 从图3 可知，DNA 的扩增效果较好，符合常规的ITS rDNA 序列长度，可以用来测序。

将扩增的菌株A8 ITS rDNA 序列送至北京六合华大基因科技股份有限公司测序，测序后去除载体及引物序列，共610 bp，正向序列结果为：

图3 菌株A8 ITS rDNA 的PCR 产物电泳图谱Fig. 3 Electrophoresis of PCR production of ITS rDNA from strain A8

CCG TAAACTACTGCGGAGACATTAGTGATAT AGGACGTCCAACTTAACTTGGAGTCCGAACTCTCA CTTTCTAACCCTGTGCACTTGTTTGGGATAGTAACT CTCGCAAGAGAGCGAACTCCTATTCACTTATAAAC ACAAAGTCTATGAATGTATTAAATTTTATAACAAA ATAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGC ATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAA TGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAAT C T TTGAACGCACCTTGCGCTCCATGGTATTCCGTGGA GCATGCCTGTTTGAGTGTCATGAATACTTCAACCC TCCTCTTTCTTAATGATTGAAGAGGTGTTTGGT TTC TGAGCGCTGCTGGCCTTTACGGTCTAGCTCGT TCG TAATGCATTAGCATCCGCAATCGAACTTCGGATTG ACTTGGCGTAATAGACTATTCGCTGAGGAATTCTA GTCTTCGGATTAGAGCCGGGTTGGGTTAAAGGAA GC TTCTAATCAGAATGTCTACATTTTAAGATTAGA TCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAG CATATCAATAAGCGGAGGAA

最后将测定的序列在NCBI 数据库中进行BLAST 比对分析，结果显示菌株A8 的基因序列与胶红酵母菌（Rhodotorula mucilaginosa）同源性为100%，结合形态学鉴定，确定菌株A8 为胶红酵母菌，命名为（Rhodotorula mucilaginosaA8，R. mucilaginosaA8）。进一步查询，该菌在通常情况下对动物和人体不致病[11-13]。 另外，为了研究菌株A8 的发育系统在微生物种群中的地位，根据BLAST 比对结果，下载同源性99%以上序列， 采用MEGA 6.06 构建系统发育树，见图4。

2.3 菌株A8 的生长特性

菌株A8 在28 ℃YPD 液体培养基中生长，最初的6 h 内生长比较缓慢， 属于延滞期；6～18 h 其生长量呈对数增长，进入对数生长期；18～48 h 处于稳定阶段， 此时菌株呈现波动性增长，48 h 时菌体生长量达到最大值， 之后菌体生物量逐渐降低，进入衰亡期，见图5。

2.4 单因素试验结果

按照表1 进行单因素试验， 得出了各试验因素成分添加量对2-KGA 产量的柱形图。 再根据BBD试验设计原理，选择在单因素试验中2-KGA 产量最优的3 个水平值进行后续响应面优化试验设计。

图4 基于菌株A8 ITS rDNA 序列构建系统发育树Fig. 4 Phylogenetic trees based on the ITS rDNA sequences of strain A8

图5 菌株R. mucilaginosa A8 的生长曲线Fig. 5 Growth curve of strain of R. mucilaginosa A8

2.4.1 L-山梨糖添加量对2-KGA 产量的影响 L-山梨糖是混菌发酵生产VC 前体2-KGA 的原料。在工业生产中， 投糖量过低会造成其他资源的浪费，而过高的糖质量浓度又会抑制发酵菌系的细胞生长与产酸。 糖质量浓度在100 g/L 时，2-KGA 产量最高，但与80 g/L 和90 g/L 的糖质量浓度比较，其酸产量相差不大，见图6。按照BBD 设计原理，选择糖质量浓度为80、90、100 g/L 共3 个水平进行后续设计。

图6 不同L-山梨糖添加量对新菌系K.v+R.m A8 产酸的影响Fig. 6 Effect of L- sorbitol concentration on 2-KGA production by a new mixed culture of K.v+R.m A8

2.4.2 尿素添加量对2-KGA 产量的影响 在微生物生长过程中，尿素不仅作为氮源，而且也作为一种生理碱调节微生物生长的pH 环境[14]。 在发酵终点，不同尿素添加量对2-KGA 产量影响较大，见图7。按照BBD 设计原理， 选择尿素质量浓度为10、12、14 g/L 共3 个水平进行后续设计。

2.4.3 玉米浆添加量对2-KGA 产量的影响 玉米浆中含有多种氨基酸等物质供菌体生长，是影响2-KGA 产量的重要因素之一[15]。 在发酵终点时，玉米浆质量浓度对2-KGA 产量没有太大影响， 但是不同质量浓度的添加量可以起到缩短发酵周期的作用，见图8。 按照BBD 设计原理，选择玉米浆质量浓度为15、20、25 g/L 共3 个水平进行后续设计。

图7 不同尿素添加量对新菌系K.v+R.mA8 产酸的影响Fig. 7 Effect of urea addition amount on 2-KGA production by a new mixed culture of K.v + R.m A8

图8 不同玉米浆添加量对新菌系K.v+R.m A8 产酸的影响Fig. 8 Effect of corn liquor amount on 2-KGA production by a new mixed culture of K.v+R.m A8

2.4.4 CaCO3添加量对2-KGA 产量的影响 在发酵培养基中添加CaCO3的主要目的是为了缓冲发酵液中的酸，避免造成酸的反馈抑制作用。 不同的CaCO3添加量可以缩短发酵周期，见图9。按照BBD设计原理，选择CaCO3质量浓度为1、3、5 g/L 共3 个水平进行后续设计。

2.4.5 MgSO4添加量对2-KGA 产量的影响 据文献报道[6，16-17]，2-KGA 在还原酶的作用下生成L-艾杜糖酸， 而高质量浓度的MgSO4可激活2-KGA 还原酶，使2-KGA 还原成L-艾杜糖酸，导致2-KGA 产量下降。 MgSO4质量浓度为0.4 g/L 时，2-KGA 产 量最高，见图10。 按照BBD 设计原理，选择MgSO4质量浓度为0.2、0.3、0.4 g/L 共3 个水平进行后续设计。

图9 不同CaCO3 添加量对新菌系K.v+R.m A8 产酸的影响Fig. 9 Effect of CaCO3 amount addition on 2-KGA production by a new mixed culture of K.v+R.m A8

图10 不同MgSO4 添加量对新菌系K.v+R.m A8 产酸的影响Fig. 10 Effect of MgSO4 amount on 2-KGA production by a new mixed culture of K.v+R.m A8

2.4.6 KH2PO4添加量对2-KGA 产量的影响 KH2PO4是培养基中的常用成分， 磷和钾促进芽孢的形成，且K+能调节细胞渗透压，保持酶活性，磷是核酸的重要组成元素， 同时对pH 值也有一定缓冲作用。在发酵终点时，不同KH2PO4添加量对2-KGA 产量影响较大， 见图11。 按照BBD 设计原理， 选择KH2PO4质量浓度为0.6、0.8、1.0 g/L 共3 个水平进行后续设计。

图11 不同KH2PO4 添加量对新菌系K.v+R.m A8产酸的影响Fig. 11 Effect of KH2PO4 amount on 2-KGA production by a new mixed culture of K.v+R.m A8

2.5 响应面试验结果

按照1.2.7 中方法， 采用BBD 原理对表2 中数据进行响应面设计， 得到要分两批次进行的54 组不同因素组合试验，试验结果见表3。

对表3 中的数据进行多项回归分析，获得2-KGA产量对6 个编码自变量L-山梨糖（x1）、尿素（x2）、玉米浆（x3）、CaCO3（x4）、MgSO4（x5）、KH2PO4（x6）的二次多项回归方程模型（1）：

表3 BBD 实验设计及结果Table 3 Design and results of Box-Behnken Design

（续表3）

式中，Y：2-KGA 质量浓度 （g/L）；x1：L-山梨糖质量浓度（g/L）；x2：尿素质量浓度（g/L）；x3：玉米浆质量浓度（g/L）；x4：CaCO3质量浓度（g/L）；x5：MgSO4质量浓度（g/L）；x6：KH2PO4质量浓度（g/L）。

2.5.1 回归方程方差分析 对模型方程回归系数进行显著性检验分析，结果见表4。

对模型方差分析结果表明，相关系数R2=0.954 6，校正系数R2Adj=0.905 5，本实验所选用模型（1）具有极度显著性（P＜0.000 1），说明该方程与实际情况拟合良好， 可以用该方程代替真实实验点进行分析。对回归方程系数进行显著性检验，x1、x2对产酸有极显著影响（P＜0.001），x4、x22对产酸有高度显著影响（P＜0.01），x12对产酸有显著影响（P＜0.05），其他项系数均不显著。 依据系数估计值，因素的主效应关系为：x1=1.78，x2=8.28，x3=0.032，x4=1.15，x5=0.42，x6=0.62， 尿素＞L-山梨糖＞CaCO3＞KH2PO4＞MgSO4＞玉米浆。 在α=0.05 显著水平下剔除不显著项后，对模型（1）进行优化可得模型（2）：

表4 回归方程方差分析Table 4 Analysis of variance for the fitted regression equation with 2-KGA yield as a function

Y=58.71-1.78x1+8.28x2+1.15x4-0.96x1x2+0.79x1x4-0.096x2x4-1.46x12-2.29x22+0.096x32-0.74x42+0.74x52+0.62x62

式中，Y：2-KGA 质量浓度 （g/L）；x1：L-山梨糖质量浓度（g/L）；x2：尿素质量浓度（g/L）；x3：玉米浆质量浓度（g/L）；x4：CaCO3质量浓度（g/L）；x5：MgSO4质量浓度（g/L）；x6：KH2PO4质量浓度（g/L）。

2.5.2 响应面分析与优化 根据BBD 模型探讨各因素及其交互作用对2-KGA 产量的影响。 选取显著性影响因素L-山梨糖、尿素、CaCO3为研究对象，得出两因素交互作用对产酸影响的3D 曲面图，见图12。 可知，低水平和高水平的影响因素都不利于酸产量的提高， 其中尿素对酸产量的影响最为显著，表现为曲线较陡。在各因素中，尿素与L-山梨糖的交互作用最为显著，从变化速率来看，尿素组分的主效应大于L-山梨糖。由此可知，在试验水平内，适当的增加尿素添加量有利于酸产量的提高。

2.5.3 响应面模型验证试验结果 为了检验响应面模型预测值的准确性，利用优化后的发酵培养基条件（L-山梨糖80 g/L、尿素14 g/L、玉米浆15 g/L、CaCO31.58 g/L、MgSO40.3 g/L、KH2PO41.0 g/L） 进行3 组平行试验，产酸量分别为69.85、70.27、70.12 g/L，平均值为70.08 g/L， 与模型预测值70.38 g/L 基本一致，说明试验所用模型能够较好地预测实际发酵产酸情况。

3 结 语

图12 两因素交互作用对2-KGA 产量的影响Fig. 12 Effect of cross-interaction between two factors on 2-KGA production

经形态学鉴定和分子鉴定，确定新筛选出的伴生菌株A8 为胶红酵母（R. mucilaginosa）。 菌株A8在最初的6 h 内生长处于延滞期；6～18 h 处于对数生长期；18～48 h 处于稳定期，48 h 之后进入衰亡期。 通过单因素试验优化、响应面法分析以及试验验证，得出新菌系发酵培养基为：L-山梨糖80 g/L、尿素14 g/L、 玉米浆15 g/L、CaCO31.58 g/L、MgSO40.3 g/L、KH2PO41.0 g/L。 利用优化后的培养基对新菌系进行VC混菌发酵，2-KGA 产量为70.08 g/L， 转化率达81.3%，显著高于工业生产菌系G. oxydans+B. megaterium2980 的产酸质量浓度55.38 g/L[17]。 在二步发酵法研究初期， 从L-山梨糖到2-KGA 的转化率仅为39.7%[18]。 仲崇斌等[19]以掷孢酵母作为伴生菌与氧化葡萄糖酸杆菌组成新混菌体系， 转化率达66.81%。徐婷婷等[20]以短小芽胞杆菌HJ-04 为伴生菌进行混菌产酸研究，在发酵终点48 h 时，产酸质量浓度达76.9 mg/mL（糖质量浓度94.95 mg/mL），转化率约为75.2%。 吕淑霞等[18]以枯草芽孢杆菌A9 为伴生菌进行发酵产酸研究时， 糖酸转化率达到了94%左右。郭礼强等[21]利用紫外线（UV）、亚硝基胍（NTG）及两者的复合诱变方法选育得到一株苏云金芽孢杆菌UN-366，转化率达到89.2%。在促K. vulgare产酸能力及转化率方面， 胶红酵母A8 显著高于B.megaterium2980、 掷孢酵母以及短小芽胞杆菌HJ-04，而与枯草芽孢杆菌A9 比较则较弱，因此，接下来应着手于胶红酵母A8 和枯草芽孢杆菌A9 的对比研究，找出真核微生物和原核微生物促产酸能力差异的原因。 另外， 经诱变后的苏云金芽孢杆菌UN-366 能使转化率达到89.2%， 后续可以借鉴此方法来对胶红酵母A8 进行诱变处理， 以更进一步提升其促进K. vulgare产酸的能力。 最后伴生菌株胶红酵母A8 在通常情况下对动物和人体不致病，可以与K. vulgare组成新菌系，用于工业生产。