副结核病诊断和防控研究进展

2020-05-09郭永丽高明春

中国动物检疫 2020年5期

郭永丽，张君，孙刚，高明春

（1.黑龙江省疾病预防与控制中心，黑龙江哈尔滨 150030；2.东北农业大学，黑龙江哈尔滨 150030）

副结核病又称约翰氏病（JD），是一种慢性、传染性肉芽肿性肠炎，表现为患病动物持续腹泻、体重减轻、生产力下降，最终死亡，可对社会经济、动物福利和公共卫生产生重要影响。为此，世界动物卫生组织（OIE）将其列为须通报动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。目前，本病广泛流行于世界各国，特别是一些牛羊养殖业较发达的国家。对48 个国家进行副结核病调查，结果发现大约50%的国家超过20%的牛群和羊群患有副结核病[1]。近年来有研究[2]表明，副结核病的病原可能与人类疾病关系密切，在50%的以持续性腹泻为特征的克罗恩病患者血液中可分离出副结核病病原。为及时诊断并防控该病，本文主要从病原学、危害及流行现状、诊断、疫苗和防控措施等方面，对副结核病进行概述。

1 病原学

副结核病是由鸟分枝杆菌亚种副结核亚种（MAP）感染所引起的。MAP 能够感染所有反刍动物（如牛、羊、美洲驼、鹿等），其中牛感染最为常见，通常在幼龄期（断奶前）感染，并且大部分3 岁以上才表现临床症状。据报道[3]，杂食动物和食肉动物（如野兔、狐狸、鼬鼠、猪）以及非人类灵长类动物也可感染MAP 。

MAP 是一种特殊的细胞内病原体，只能在易感动物的宿主细胞内繁殖，但能够在宿主环境以外的恶劣条件下长期存活。受感染的牲畜可不定期通过排便、泌乳排放病原体，造成MAP 的粪-口传播，这也被认为是主要的感染途径[4]。

2 危害及流行分布

副结核病造成经济损失的因素包括产奶量下降、屠宰价值降低、被动淘汰增加、产犊间隔延长、久配不育以及诊断与潜在的治疗费用。在美国受MAP 感染的奶牛群中，每头奶牛每年的经济损失估计为21～79 美元[5-6]；1996 年，美国因MAP感染导致奶牛产奶量减少，由此引起的经济损失为（2±1.6）亿美元[7]。在澳大利亚、加拿大、法国和英国奶牛群中，每头奶牛每年的经济损失估计分别为45～88 澳元、49 加元、234 欧元和27 英镑[8-11]。有关其他物种感染MAP 的经济损失报道较少。副结核病对英国绵羊业造成的经济损失估计为每年40 万～3 200 万英镑[12]；MAP 感染使意大利奶羊场的利润效率从84%下降到64%[13]。此外，MAP 与人类克罗恩病之间的关系一直是争论的热点[14]。从副结核病牛与克罗恩病人肠道感染症状的相似性以及克罗恩病患者体内大多能分离到MAP 来分析，副结核病具有潜在的人兽共患传染病风险，它对公共卫生的影响意义重大[15]。

副结核病呈世界性分布，美国、英国、加拿大、澳大利亚、爱尔兰等国家均有该病流行。在美国至少22%的牛场中，有超过10%的牛感染MAP[16]。在欧洲，牛感染MAP 的患病率约为20%；在瑞士和西班牙，绵羊和山羊感染MAP 的患病率均超过20%[17]；在新西兰，69%的农场至少有1 头动物MAP 检测呈阳性[18]。在英国，MAP 的牧场感染率为59%～77%[19]。

我国1953 年于内蒙古首次发现副结核病，随后在黑龙江省、吉林省、河北省等地均有该病暴发，几乎覆盖我国北方大部分地区[20]。2012 —2014 年对西藏部分地区的468 份牦牛血清进行MAP 抗体检测，结果发现总体阳性率为1.92%[21]。2015 年MAP 抗体检测结果显示，内蒙古、黑龙江省、湖北省、四川省、安徽省、江苏省规模化牧场中的牛MAP 抗体阳性率分别为2.09%、3.90%、2.05%、5.23%、8.00%、1.22%[22]。2014—2015 年采集的3 600 份牛血清样品MAP 抗体检测显示，MAP 抗体平均阳性率为2.29%，其中山西、西藏、新疆、河北、青海、重庆、湖北等省（市区）的MAP抗体阳性率分别为3.75%、3.5%、2.2%、2.0%、1.5%、0.75%、0.5%[23]。

3 诊断

由于病原的特殊性，MAP 感染后机体的免疫反应较为复杂，需要结合不同感染阶段的特征以及动物群体的实际情况，灵活使用不同的检测方法进行持续追踪，以寻找适合不同时期的检测方法。

3.1 亚临床期诊断

亚临床期诊断的主要目的是在感染动物表现临床症状前做到早期确诊。有效的诊断方法应能从外表健康的动物中区分出感染动物[24]，并揭示其是否及何时具有传染性[25]。虽然可以通过MAP 特异性PCR 来检测粪便排菌情况，从而确定动物是否感染MAP，却不能显示何时具有传染性。这种诊断方法在流行率低的动物群体中根除副结核病是有效的[26]。检测牛抗体反应的新型MAP 分泌蛋白SF2 抗原可用于MAP 感染的早期或亚临床阶段[27]。IFN-γ 释放试验可用于检测细胞免疫介导的早期MAP 感染[28]，但副结核菌素抗原成分的复杂性会影响到检测的特异性，所以需要对其进行改进和标准化[29]。

3.2 临床期诊断

临床期诊断主要针对体液免疫反应，如ELISA 检测MAP 抗体。犊牛、羔羊感染MAP 后需要经较长的时间（1 年以上）才能产生ELISA抗体，而在新生动物中，较早检测出的ELISA抗体可能是由于吸收了初乳中的母源抗体所导致的[30]。ELISA 的滴度可以预测MAP 排菌的概率，这在通过清除感染牛来减少传播进而控制牛群副结核病时较为实用。此种情况下，ELISA 可以代替粪便培养（PFC）或粪便PCR（IFC）检测，但是缩短检测间隔时间很重要[31]。

3.3 整群监测诊断

环境采样检测是一种用于确定群体MAP 感染状况的快速诊断方法，然而这种采样方法仅在相对密集的家畜饲养作业（如奶牛饲养）中足够敏感[32]。在放牧饲养（如绵羊和牛群）、环境采样检测中就没有足够的敏感性[33]。PCR 检测相较于混合环境样品的培养，不仅可减少处理时间和成本，而且检测不依赖于样本中的活菌量，所以会有更高的灵敏度，尤其在冬季或在肥料积累时间过长的地方采集的样品。

使用商品化ELISA 或PCR 检测大缸奶/混合奶样是方便价廉的奶牛副结核病整群筛查方法。为确定牛群的MAP 感染状况，可以使用ELISA 或者直接PCR 检测大缸奶中的MAP 特异性抗体或者MAP 抗原。大缸奶检测在短期内的一致性较高，但长期可能会受到畜群规模和ELISA 阳性个体MAP 流行率的影响[34]。

4 疫苗

理想的MAP 疫苗不仅能够预防感染，保持阴性群体无MAP，还能够保护高流行率群体中的年轻和易感动物。研发MAP 疫苗的一个关键在于能够引发抗感染免疫保护反应。现有疫苗可部分降低感染性或粪便中MAP 排菌量，延长感染动物的潜伏期，减缓MAP 排菌量由低向高发展，或降低副结核病临床病例的累积发病率，但对预防MAP 感染无效[35-38]。菌苗、亚单位疫苗和载体疫苗也已研发上市，但效果均不理想[39-42]。减毒活疫苗（LAV）的一个优点是，它们能够刺激细胞介导的免疫反应和体液免疫反应。LAV 在小鼠模型中产生了强大的保护作用[43]，但在山羊模型中的研究[44]表明，LAV 未显示有保护作用；另有研究[45]表明，LAV可以显著减少粪便排菌量。LAV 尚未在牛模型中进行试验。此外，单基因敲除株可能不是最佳的候选疫苗，因为它们的减毒程度不足以刺激机体产生保护性免疫反应进而消除疾病。

Gudair 疫苗已广泛应用于澳大利亚绵羊群，并已成为控制副结核病的主要措施。使用这种灭活疫苗降低了澳大利亚绵羊群MAP 感染和粪便排菌引起的流行率，并大大降低了死亡率[46-47]。但这种疫苗不能预防MAP 感染，且不良反应也较大，单独应用不能根除MAP 感染[36]。与绵羊相比，牛尚无有效的疫苗，而缺乏有效防止MAP 感染的疫苗是牛副结核病控制计划进展缓慢的一个主要因素。在全球范围内，无论是活疫苗（Neoparasec）还是灭活疫苗（Mycopar，ID Lelystad，Gudair，Silirum），大多都是以矿物油佐剂配制的MAP 菌株316F 为基础的，其中只有Mycopar 疫苗在美国获得许可，且仅用于5%的美国乳品经营牧场[48]。Mycopar 疫苗受到当地兽医机构的严格控制，因为在标准牛结核病检测中接种疫苗的牛更容易出现结核病假阳性[49]。

5 防控措施

目前世界上对副结核病尚无有效的治疗措施。虽然链霉素、异烟肼、利福平等药物可以减轻或缓解与MAP 感染相关的临床症状（主要是体重减轻和腹泻），并有助于延长动物的寿命，但对副结核病的治愈没有任何效果[50]。此外药物的长期使用不仅会让病原体对药物产生耐药性，更会增加药物在机体内的残留。疫苗的使用虽然可以减少副结核病临床症状的发生，但是仍然无法彻底防止病畜向外界排菌，并且在接种后无法通过检测来鉴别免疫动物和感染动物，而处于亚临床期的感染动物持续向外界排菌会带来更大的安全隐患[51]。副结核病的防控需要根据不同目标（减少患病率还是根除MAP），采取不同的防控策略，如扑杀携带MAP的动物，采用减少新生儿/幼畜感染的卫生措施以及接种疫苗等[1]。由于副结核病是一种慢性消耗性疾病，临床表现最早出现在1～2 岁，一般出现在4岁以后，所以建议副结核病的防控周期至少为5 年。

5.1 清除MAP 感染牛

尽早识别并清除MAP 感染动物、减少粪便排菌污染环境，可以切断MAP 感染其他易感动物尤其是新生动物的途径。扑杀已知MAP 感染牛的后代也是清除MAP 感染的一种措施，因为胎儿在子宫内感染MAP 的概率很高[52]。自2006年起，国际通用2 种副结核病控制程序，即大缸奶质量保证措施（bulk milk quality assurance programme，BMQAP）与密集副结核程序（intensive paratuberculosis programme，IPP）。IPP 于1998 年推出，目标是从受感染的牛群中根除副结核病，并在经认证的无副结核病牛群中进行低风险贸易[53]。但是，农场主对这一方案的参与率很低，因为该方案的费用相对较高。因此，2006 年启动了一项新的更经济的BMQAP 策略，旨在减少人类通过乳制品接触MAP。该策略要求降低运送到加工厂的牛奶中的MAP 滴度低于103PFU/L[54]。

防控策略中对检测后牛群的状态进行了分类。“状态A”指MAP 检测阴性群，“状态C”为MAP检测阳性群，“状态B”是“状态C”牛群在扑杀所有MAP 阳性动物后的状态。包括荷兰在内的几个国家规定乳品加工厂收购的牛奶至少要来源于“状态B”牧场。当牧场处于“状态C”时，加工厂不允许收购其产出的牛奶。

5.1.1 IPP 执行IPP 策略的牧场要进行5 个年度评估：第1 年评估，采用血清ELISA 和IFC 检测所有≥2 或3 岁牛，第2～5 年评估，均采用PFC或IFC 检测所有≥2 或3 岁牛。在5 个年度牧场评估测试中均为阴性的牧场可被定义为MAP 阴性牧场，反之则为阳性场，需要重新进行5 个年度牧场评估测试。因此，牧场最短可在5 年获得无MAP阴性牧场认证。阴性场认证后，每2 年对MAP 阴性牛群所有≥2 岁牛进行1 次粪便混合样本PFC监测，阳性场则需对混合样本中每个样本每年重新逐一进行IFC 检测[54]（图1）。

5.1.2 BMQAP BMQAP 相对IPP 而言，程序简单易行，所有的评估检测都可以只依靠ELISA 来完成。执行BMQAP 策略的牧场，在最初的评估和监测程序中，ELISA 结果可通过PFC 来验证。检测为阴性的牧场被暂定为无MAP 感染牧场，进入到每2 年1 次的牛群ELISA 监测程序[54]；为阳性的牧场，每年对所有≥3 岁的牛，实行MAP 阳性动物淘汰处理，一直到检测不到阳性动物为止（图1）。