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miRNA-224-5p靶向JAG1抑制乳腺癌细胞自噬活性的机制研究

2020-05-09王毅超谢姣贵潘印朱杰杨合慧朱韬李招云

浙江医学 2020年7期
关键词:报告基因荧光素酶质粒

王毅超 谢姣贵 潘印 朱杰 杨合慧 朱韬 李招云

乳腺癌是全世界妇女最常见的肿瘤之一,其发病率位居女性肿瘤的第2位[1]。目前我国女性乳腺癌发病率呈明显的增长趋势,预计至2021年,中国将有超过220万例女性罹患乳腺癌[2]。目前关于乳腺癌发生、发展的分子机制尚未完全阐明,且缺少可靠、准确的分子标志物用于早期诊断、动态监测及预后分析;因此,探讨乳腺癌进展的相关分子机制,寻找新的肿瘤标志物已经成为乳腺癌研究的重点和难点。自噬是真核细胞生物中进化保守地对细胞内物质进行周转的重要过程,是细胞内一种通过溶酶体降解长寿命蛋白和受损细胞器的代谢途径[3-4]。自噬可减少缺氧诱发的肿瘤坏死,抑制炎症细胞浸润,从而参与肿瘤的发生、发展[5-6]。微小RNA(microRNA,miRNA)是生物体内普遍存在且进化上高度保守的一类非编码小分子RNA,可通过调节靶基因,参与转录后基因表达调控,细胞的增殖、分化、凋亡,个体发育及新陈代谢等生理活动[7]。研究显示,miRNA-224-5p在肿瘤组织、外周血或细胞中的表达谱明显不同于正常组织或细胞[8]。因此,本研究测定了乳腺癌患者血清中miRNA-224-5p的表达,并探讨乳腺癌细胞中miRNA-224-5p对自噬活性的影响。

1 对象和方法

1.1 对象 收集台州市中心医院2017年1月至2018年9月收治且行手术治疗的40例乳腺癌女性患者(乳腺癌组)及同期性别、年龄相匹配的40例健康体检者(健康对照组)的血液样本。乳腺癌组患者年龄(49.5±10.6)岁;癌胚抗原水平(20.37±15.21)kU/L;CA153 水平为(33.18±10.56)μg/L;肿瘤位置:右乳 14 例,左乳 26例;手术类型:乳腺癌保乳术22例,改良乳腺癌根治术15例,肿块切除术2例,单纯乳房切除术1例;术后病理检查:Luminal A型11例,Luminal B型19例,三阴性6 例,Her-2(3+)2 例,Her-2(2+)2 例;合并高血压 5 例,糖尿病1例;均无饮酒史或吸烟史。健康对照组年龄(48.0±9.0)岁。本研究经医院伦理委员会审查批准,两组对象或家属均签署知情同意书。

1.2 材料 DMEM培养基购自美国Gibco公司,Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司,Trizol试剂盒购自美国 Invitrogen 公司,LC3 抗体(L7543,1∶2 000)购自美国 Sigma 公司,SQSTM1/p62(sc-28359,1∶500)购自美国Santa cruz公司;实验所用质粒购自苏州吉马基因公司。

1.3 血清miRNA-224-5p表达检测 采用实时定量逆转录-聚合酶链反应(qRT-PCR)。使用Trizol试剂盒提取血清总RNA,采用RNA 6000 Nano LabChip Kit(安捷伦)和Bioanalyzer 2100测定RNA的纯度和浓度,然后置于-80℃冰箱内备用。使用Fastking cDNA第一链合成试剂盒(北京天根生化科技有限公司),严格按照说明书操作,配置为20μl的体系,将提取到的核糖核苷酸反转录为互补的第一链DNA。使用Super Real PreMIix Plus(北京天根生化科技有限公司)和ABI7300 Plus系统进行热循环完成qRT-PCR。引物序列如下:miRNA-224-5p 正义为 5′-TGCCCTAGTGACTACAAAGTCG-3′,反义为 5′-CAGTGCAGGTCCGAGGTAT-3′;U6 正义为5′-CTCGCTTCGGGCAGCACA-3′,反义为 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′;miRNA-224-5p mimics:5′-UCAAGUCACUAGUGGUUCCGUUUAG-3′,miRNA-224-5p inhibitor:5′-CUAAACGGAACCACUAGUGACUU -GA-3′。以U6为内参,采用 2-ΔΔCt法计算相对表达量。

1.4 MDA-MB-231细胞自噬相关蛋白表达水平检测 采用免疫印迹试验。(1)取乳腺癌细胞株MDA-MB-231,以8×104/孔浓度铺12孔板,每孔加完全培养基1ml;当细胞融合度为60%左右时,换成无血清DMEM培养基,饥饿处理24h,使用Lipofectamine 2000及20nM miRNA-224-5p mimics(空白对照组)、miRNA-224-5p inhibitor(抑制物组)或空质粒(空质粒组)转染MDAMB-231细胞。(2)转染后48h收集细胞,对细胞总蛋白进行裂解和纯化,取细胞裂解物进行自噬相关蛋白水平检测,包括 SQSTM1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ等。

1.5 miRNA-224-5p靶基因预测及双荧光素酶报告基因实验 采用TargetScan 7.2(http://www.targetscan.org)、MiRDB(http://mirdb.org/miRDB/)在线预测 miRNA-224-5p靶基因。采用双荧光素酶报告基因实验检测miRNA-224-5p的靶基因是否为JAG1。将野生型的JAG1 3′-UTR片段或其突变体(没有预测的miRNA-224-5p靶序列)分别构建到pmirGLO质粒上,将构建的2种质粒pmirGLO-JAG1野生型或突变型分别与miRNA-224-5p或阴性对照(空载体)共转染293T细胞;转染48h后,收集细胞裂解液,采用双荧光报告实验系统检测荧光活力,生物荧光检测仪分析相对值,即相对荧光强度。

1.6 统计学处理 采用SPSS 21.0统计软件。计量资料用表示,多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA),两两比较比较采用SNK-q检验;两组间比较采用两独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miRNA-224-5p在乳腺癌血清中的表达 乳腺癌组血清miRNA-224-5p相对表达量为188.51±59.26,明显高于健康对照组的41.63±14.29,差异有统计学意义(P<0.05)。这初步表明miRNA-224-5p的表达上调与乳腺癌的发生存在一定的相关性。

2.2 MDA-MB-231细胞自噬相关蛋白表达水平 抑制miRNA-224-5p表达后,乳腺癌MDA-MB-231细胞SQSTM1蛋白表达水平较空质粒组、空白对照组明显降低,LC3Ⅰ蛋白表达水平较空白对照组明显降低,LC3Ⅱ蛋白表达水平较空质粒组、空白对照组明显升高,差异均有统计学意义(均P<0.05),见图1和表1。这说明miRNA-224-5p具有抑制乳腺癌细胞自噬活性的作用。

2.3 双荧光素酶报告基因实验验证靶基因 双荧光素酶报告基因实验检测结果显示,miRNA-224-5p与携带JAG1野生型3′-UTR的载体共转染后,与阴性对照组相比,相对荧光强度明显降低(P<0.05);而缺失靶位点的突变型3′-UTR与miRNA-224-5p共转染后,与阴性对照组相比,相对荧光强度差异无统计学意义(P>0.05),见图2和表2。这表明JAG1是miRNA-224-5p的靶基因。

图1 3组MDA-MB-231细胞自噬相关蛋白表达的电泳图

表1 3组MDA-MB-231细胞自噬相关蛋白水平

图2 生物信息学预测miRNA-224-5p与JAG1结合的靶基因序列

表2 双荧光素酶报告基因实验的相对荧光强度

3 讨论

乳腺癌是威胁女性健康的常见恶性肿瘤[9],其在世界范围内的发病率持续增高[10-11]。我国女性乳腺癌发病率也呈明显的增长趋势。因此,开发新型标志物以早期发现肿瘤生长情况,实现对乳腺癌患者的早期诊断和个体化治疗,是十分重要的工作。近年来,miRNA在肿瘤的发生、发展中发挥了重要作用[12-13]。miRNA在各体液中稳定表达且具有肿瘤特异性、高度稳定性,提示其作为疾病生物标志物的潜能[14]。miRNA-224-5p是哺乳动物中发现的一组miRNA前体,位于chrxq28,GABRE基因区,是一个已知的转录静止区。已有研究提示,miRNA-224在许多肿瘤中表达异常,可调控与肿瘤发生、发展相关的许多关键的生物学过程[15-16]。在非小细胞肺癌中,miRNA-224-5p通过靶向RASSF8促进癌细胞的增殖[17];在骨肉瘤中,miRNA-224-5p参与了肿瘤的发生等[18]。目前关于miRNA-224-5p是否参与乳腺癌发生的研究较少。

本研究检测了miRNA-224-5p在乳腺癌患者血清中的表达,结果发现较健康对照组明显升高。同时检测了乳腺癌MDA-MB-231细胞中 SQSTM1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ等3种自噬蛋白的表达,结果显示抑制miRNA-224-5p表达后,SQSTM1、LC3Ⅰ蛋白表达明显降低,LC3Ⅱ表达明显升高。这说明在乳腺癌患者中miRNA-224-5p的升高伴随着自噬活性的减弱。此外还发现在过表达实验中,miRNA-224-5p对自噬作用无明显的影响,这可能是miRNA-224-5p在MDA-MB-231细胞中天然高表达的原因。然而在抑制实验中,miRNA-224-5p水平直接影响细胞自噬水平,miRNA-224-5p可抑制细胞的自噬活性。故本研究初步表明,miRNA-224-5p可通过抑制乳腺癌自噬而参与乳腺癌的进展。

越来越多研究表明,miRNA可通过与肿瘤相关靶蛋白的miRNA结合后,作为促癌因子或抑癌因子参与肿瘤的发生过程。为了阐明miRNA-224-5p抑制自噬的分子机制,本研究鉴定了可能由miRNA-224-5p调节自噬途径中的潜在靶标。首先,通过生物信息学的网络软件TargetScan 7.2和MiRDB对miRNA-224-5p的靶基因进行了预测,结果发现JAG1有2个miRNA-224-5p潜在的结合位点,则推测JAG1为其靶基因。之后通过双荧光素酶报告基因实验对预测的靶基因作了进一步验证。结果显示miRNA-224-5p可互补结合JAG1的mRNA位点,即JAG1为miRNA-224-5p的靶基因。JAG1基因在染色体上定位于20p12,是5种Notch配体中的一种,属于DSL蛋白家族,是单次跨膜蛋白,在细胞增殖分化过程中主要通过激活Notch信号通路发挥作用[19]。有研究表明,阻断JAG1可以抑制乳腺癌细胞的继续分裂,甚至引起细胞死亡,抑制Notch1表达后乳腺癌干细胞微球体的生成数量会下降,并且细胞的侵袭性、肿瘤的繁殖力和侵袭力均会减弱,这些预示着Notch1与乳腺癌细胞的恶性生物学行为密切相关[20-21]。因此,笔者推测miRNA-224-5p可能是靶向JAG1通过Notch信号通路发挥作用,从而参与乳腺癌的恶性行为。

综上所述,miRNA-224-5p在乳腺癌患者血清中高表达,在MDA-MB-231细胞中miRNA-224-5p通过靶向JAG1抑制自噬活性。后续将从分子水平方面进一步验证miRNA-224-5p与JAG1的直接相互作用,为乳腺癌发生、发展的分子机制提供更多的理论依据。

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