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桑寄生提取物对人结肠癌HT-29细胞侵袭迁移的影响及作用机制

2020-05-09冯海洋刘卓付志璇

浙江医学 2020年7期
关键词:桑寄生空白对照结肠癌

冯海洋 刘卓 付志璇

结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一,近年来发病率居高不下,在全世界位居第三,我国发病率和死亡率也逐年升高[1-2]。对于结肠癌的治疗,目前采用以外科手术为主、化疗为辅的综合治疗方式,但是疗效并不理想,且药物毒副反应较大,肿瘤耐药明显,对患者的生存率提高不明显[3]。此外,临床上很大一部分患者在诊断结肠癌时已出现远处转移,失去了手术机会,治疗困难。可见,结肠癌的预后与是否发生转移密切相关[4]。因此,针对结肠癌侵袭转移的基础研究及药物研究,是当前结肠癌研究领域的热点。桑寄生富含茶酸、齐墩果酸、香树脂醇、黄酮类化合物、槲皮素和凝集素等有效成分,目前已被证实具有抗肿瘤、降血压、消炎镇痛及保护神经等作用[5]。为进一步探讨桑寄生的抗肿瘤作用机制,本研究就桑寄生提取物对人结肠癌HT-29细胞增殖及侵袭迁移的影响作一探讨,并阐释其可能的作用机制,现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料及试剂 人结肠癌HT-29细胞(中国科学院上海生物细胞研究所)。桑寄饮片(安徽淮涛中药片科技有限公司)。DMEM培养基、胎牛血清(美国Gibco公司);细胞计数试剂盒(CCK-8,日本同仁化学公司);侵袭小室(Transwell)及基质胶Matrigel(美国BD公司);RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒及SDS-PAGE胶试剂盒(碧云天生物技术有限公司);兔抗人基质金属蛋白酶 2(MMP-2)、MMP-9、血管内皮生长因子(VEGF)、鼠抗人AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K抗体(美国 Abcam公司);GAPDH、HRP标记的羊抗兔IgG、HRP标记的羊抗鼠IgG(杭州华安生物有限公司);ECL发光检测试剂盒(美国赛默飞公司)。

1.2 桑寄生提取物制备 称取桑寄生饮片1 000g,蒸馏水冲洗2次,加入5 000g蒸馏水浸泡1h,文火煎煮30min;过滤,取滤液,残渣加入2 000g蒸馏水继续煎煮30min;再次提取滤液,合并两次滤液并旋转蒸发浓缩至100ml膏状提取物(相当于每ml含桑寄生药材10g),置于4℃冰箱冷藏备用。实验前取桑寄生提取物,用培养液倍比稀释制备相应实验浓度,0.22μm无菌滤器过滤后使用。

1.3 细胞培养 用DMEM培养基(内含10%胎牛血清、100g/L青霉素及100g/L链霉素)在37℃、5%CO2培养箱中培养人结肠癌HT-2细胞,待细胞生长至对数期进行传代及实验。

1.4 细胞增殖能力检测 采用CCK-8法。将对数生长期的HT-29细胞,用胰蛋白酶消化后制备单细胞悬液,以3 000个/孔接种于96孔培养板中,分为6组,每组设置3个复孔,于37℃、5%CO2培养箱中培养过夜;吸取上清后,6 组分别在每孔加入 0、0.5、1、2、4、8g/ml浓度的桑寄生提取物100μl;分别于加药24、48、72h后,加入CCK-8试剂(10μl/孔),放入培养箱继续培养4h。利用分光光度计检测各孔在550nm的吸光度(OD值),细胞存活率(%)=OD 值加药组/OD 值空白对照组×100%,并计算细胞的半数抑制浓度(IC50)。

1.5 细胞侵袭能力检测 采用Transwell法。用无血清DMEM培养液按3∶1比例稀释基质胶,取30μl基质胶稀释液均匀包被Transwell小室,于4℃过夜、风干,置于24孔培养板备用;HT-29细胞经不同浓度桑寄生提取物(0、0.5、1、2g/ml)处理 24h 后,以 5×104个/200μl接种至Transwell上室,下室加入500μl含10%胎牛血清的DMEM培养液,在37℃、5%CO2培养箱中培养24h;棉签擦掉基质胶和上室底层细胞,4%多聚甲醛固定10min,磷酸缓冲盐溶液洗3次,0.1%结晶紫染液染色20min;取小室并在用清水洗净、晾干;在显微镜下拍照,随机选取5个视野计数细胞数,取平均值;计算桑寄生对HT-29细胞的侵袭抑制率,抑制率=(1-药物组细胞数/对照组细胞数)×100%。

1.6 细胞迁移能力检测 采用划痕实验。取对数生长期的HT-29细胞悬液,接种于6孔板内;将培养板置于培养箱内培养过夜;细胞长满后,用微量枪头划线;并设置0、0.5、1、2g/ml桑寄生提取物药物处理组,加药后继续培养;在0、24h时点取样,拍照。使用Image J软件,计算细胞迁移率。

1.7 相关蛋白表达检测 采用免疫印迹试验。HT-29细胞按照上述1.5药物分组处理48h;弃上清液,磷酸缓冲盐溶液润洗细胞3遍,加入RIPA裂解液,将细胞与细胞裂解液收集于1.5ml离心管中;12 000g离心10min,取上清液;按BCA蛋白定量试剂盒操作,检测各样品蛋白浓度,加入5×Loading制样,煮沸后每组取蛋白20μg上样 SDS-PAGE 胶,电泳(80V,60~90min),转膜(120V,2h)。取出膜,于5%脱脂牛奶中室温封闭2h;TBST清洗3次,加入一抗 4℃孵育过夜;TBST清洗3次,室温孵育二抗2h;TBST再次清洗,利用ECL显影并拍照。

1.8 统计学处理 采用GraphPad Prism 6.0统计软件。计量资料用表示,不同剂量组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验;不同处理时间比较采用重复测量数据的方差分析,两两比较采用配对t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 桑寄生提取物对人结肠癌HT-29细胞增殖能力的影响 不同浓度(0、0.5、1、2、4、8g/ml)的桑寄生提取物处理细胞24、48、72h后,细胞存活率随着浓度的增加或时间的延长而降低,呈时间剂量依赖性(均P<0.05),见图1。桑寄生提取物在24、48、72h对HT-29细胞的IC50依次为(6.1±0.2)、(3.5±0.3)、(2.2±0.2)g/ml。

2.2 桑寄生提取物对人结肠癌HT-29细胞侵袭能力的影响 HT-29细胞经1、2g/ml桑寄生提取物处理24h后,侵袭细胞数分别为(504±31)、(308±21)个,明显低于空白对照组的(644±52)个,差异有统计学意义(P<0.05);而0.5g/ml桑寄生提取物处理组侵袭细胞数为(588±81)个,与空白对照组比较差异无统计学意义(P >0.05),见图2(插页)。

图1 不同浓度桑寄生提取物处理后HT-29细胞存活率

图2 不同浓度桑寄生提取物对HT-29细胞侵袭能力的影响(a:Transwell小室实验结果,×100;b:与空白对照组比较,*P<0.05)

2.3 桑寄生提取物对人结肠癌HT-29细胞迁移能力的影响 经1、2g/ml桑寄生提取物处理24h后,HT-29细胞迁移率分别为(66.7±6.4)%、(26.7±3.1)%,较空白对照组(100.0±15.0)%明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);而0.5g/ml桑寄生提取物处理组细胞迁移率为(93.3±12.1)%,与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),见图 3(插页)。

图3 不同浓度桑寄生提取物对HT-29细胞迁移能力的影响(a:划痕修复实验结果,×4;b:与空白对照组比较,*P<0.05)

2.4 桑寄生提取物对HT-29细胞侵袭迁移相关蛋白表达的影响 经0.5、1、2g/ml桑寄生提取物处理48h后,HT-29细胞侵袭迁移相关蛋白(MMP2、MMP9及VEGF)相对表达量明显低于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05),见图 4。

2.5 桑寄生提取物对HT-29细胞PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达的影响 经0.5、1、2g/ml桑寄生提取物处理48h后,HT-29细胞PI3K、AKT蛋白相对表达量与空白对照组比较,差异均无统计学意义(均P>0.05);而p-AKT、p-PI3K蛋白相对表达量明显低于空白对照组(均 P<0.05),见图 5。

图4 不同浓度桑寄生提取物对HT-29细胞内侵袭迁移相关蛋白表达的影响(a:电泳图;b:与空白对照组比较,*P<0.05)

图5 不同浓度桑寄生提取物对HT-29细胞内PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达的影响(a:电泳图;b:与空白对照组比较,*P<0.05)

3 讨论

结肠癌患者预后及5年生存率,主要取决于癌细胞转移与否[6]。因此,针对抑制结肠癌转移的药物研究具有重要意义。目前,桑寄生在临床上已用于风湿痹痛、腰膝酸软、头晕目眩等疾病的治疗。随着对桑寄生有效成分的分析与研发,其在抗肿瘤方面的作用也被逐渐关注。如桑寄生总黄酮提取物能够有效抑制人白血病细胞株HL-6的增殖[7];桑寄生凝集素能够有效抑制肝癌细胞株BEL-7402及胃癌细胞株MGC-823的增殖[8-9]。以上研究证明,桑寄生具有明确的抗肿瘤活性,但其作用机制并不清楚。为了进一步探讨桑寄生的抗肿瘤活性及其作一机制,本研究以人结肠癌细胞株HT-29为细胞模型,观察不同浓度桑寄生提取物对HT-29细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响,并分析可能的分子机制。结果显示桑寄生提取物能抑制人结肠癌HT-29细胞增殖、侵袭及迁移能力,同时下调细胞内侵袭迁移相关蛋白的表达,其作用机制可能与PI3K/AKT信号通路有关。

细胞侵袭与转移是一个复杂的过程,涉及多种信号通路及多种基因、细胞因子的调控[10-11];因此,本研究从分子水平研究肿瘤细胞侵袭转移相关的机制。近年来研究证明,细胞外基质的降解是肿瘤侵袭转移的基础,MMPs作为细胞外基质蛋白酶的主要组成部分,对细胞基质的重塑和降解起着重要作用[12]。肿瘤细胞从原位脱落,分泌MMP,其中MMP-2及MMP-9降解细胞周围基质,是肿瘤细胞侵入血液及淋巴循环并向远处迁移、从而形成新转移灶的关键环节。研究表明,MMP-2、MMP-9与结肠癌的发生与转移密切相关[12-13]。在本研究中,空白对照组HT-29细胞内MMP-2、MMP-9蛋白呈高表达,而桑寄生提取物处理后的HT-29细胞内MMP-2、MMP-9蛋白相对表达量明显降低,这说明桑寄生提取物能抑制人结肠癌HT-29细胞侵袭、转移能力,可能与抑制其MMP-2、MMP-9蛋白表达有关。VEGF是肿瘤血管生成的重要因子,与肿瘤转移密切相关;而VEGF途径抑制剂已成为肿瘤治疗的一种新治疗手段[14]。本研究结果发现,桑寄生提取物能降低HT-29细胞内VEGF表达量,从而抑制肿瘤细胞侵袭与转移。

PI3K/AKT信号通路是参与生命活动的关键信号通路,在肿瘤的发生、发展中起着重要作用[15]。研究表明,PI3K/AKT信号通路与结肠癌的发生、发展及化疗耐药等特性密切相关[16]。PI3K通过与其上游分子的作用引起PI3K结构变化,从而使AKT磷酸化而被激活,而活化的AKT通过调控其下游基因来参与肿瘤的增殖、侵袭等过程[15]。本研究结果显示,桑寄生提取物处理后的HT-29细胞内p-PI3K及p-AKT蛋白相对表达量明显降低,提示桑寄生提取物可能通过抑制PI3K/AKT信号通路,从而抑制人结肠癌细胞的侵袭与转移。

综上所述,桑寄生提取物能抑制人结肠癌HT-29细胞的增殖、侵袭及迁移,其作用机制可能与抑制PI3K/AKT信号通路有关。

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