柯孔亮 王金秋 楼婷婷 张鲁青 缪淳迪 郭宇

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是常见恶性肿瘤，在所有癌症死亡原因中居第3位[1]。在我国，CRC发病率和死亡率均较高[2]。由于CRC的发生、发展过程复杂且影响因素较多，到目前为止其发病机制尚未完全清楚[3]。微小 RNA（microRNA，miRNA）是内源性非编码RNA，分子量小，长度为22～25个核苷酸，在真核生物中广泛存在[4]。研究表明，miRNA在调控细胞生长、分化以及凋亡等过程起至关重要作用，参与肿瘤的发生、发展，是恶性肿瘤的潜在治疗靶点及预后评估指标[5-7]。miRNA-455-5p是近年发现的小分子RNA，位于第6条染色体。多项研究表明，miRNA-455-5p与多种实体恶性肿瘤相关，如在甲状腺髓样癌、黑色素瘤、胃癌等肿瘤中表达下调[8-10]。本研究团队前期检测了miRNA-455-5p在CRC及癌旁组织中的表达，同时研究了上下调miRNA-455-5p在3株结肠癌细胞株中的表达，利用信息数据库预测磷脂酰肌醇三激酶调节亚单位α（PIK3R1）可能是miRNA-455-5p的靶基因[11]。本文在前期研究的基础上，探讨miRNA-455-5p对人结肠癌HT-29细胞株PIK3R1基因靶向调控作用，以进一步验证PIK3R1基因是miRNA-455-5p的靶基因。现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 人结肠癌HT-29细胞株（上海诺百公司）。Trizol试剂（15596-026，美国 Invitrogen公司），逆转录酶（R250-01，美国Invitrogen公司），荧光染料 SYBR GreenⅠ（CS7561，美国 Invitrogen公司），RNA 酶抑制剂（E00381，立陶宛 Fermentas公司），oligo dT/Random primer/特异性引物（Oligo，美国 Invitrogen 公司），Platinum Taq DNA多聚酶（10966034，美国 Invitrogen公司），100mM dNTPs（18427013，美国 Invitrogen公司），羊抗兔-辣根过氧化物酶（ab205719，上海艾博抗公司），Protein Marker（DM111-01，TransGen公司），mTOR（7C10）兔单克隆抗体（#2983，美国Cell Signaling Technology公司），抗-AKT1抗体（bs-0115R，北京博奥森生物技术有限公司），HEK293细胞（sciencellZQ0034，上海雅吉生物科技有限公司），双荧光素酶报告基因检测试剂盒（Promega E1910，上海力敏实业有限公司），腔肠素（40904ES02，上海翊圣公司），内切酶（ER0051 BamHI，立陶宛Fermentas公司），T4 DNA连接酶（EP0061，立陶宛Fermentas公司），质粒小抽试剂盒（AP-MN-P-250，美国Ayxgen公司），质粒中抽试剂盒（AP-MD-P-25，美国Ayxgen公司），质粒大抽试剂盒（AP-MX-P-25，美国Ayxgen公司）。高速冷冻离心机（Neofuge13R，上海Heal Forcegons公司），生物安全柜（HFSafe-1800，上海 Heal Force公司），实时定量逆转录-聚合酶链反应（qRTPCR）仪（CFX96TMReal-Time Systerm，美国BIO-RAD公司），成像系统（Gel Doc2000，美国 BIO-RAD 公司），垂直电泳系统（1658003，美国BIO-RAD公司），荧光素酶测定仪（Turner GloRunner，美国Turner BioSystems公司），脂质体 2000（11668-019，美国 Invitrogen公司），减血清培养基（31985，美国GIBCO公司），荧光显微镜（IX51，日本Olympus公司）。

1.2 方法 细胞培养及转染、qRT-PCR、免疫印迹试验等在宁波市第一医院中心实验室完成；双荧光素酶报告基因实验在宁波市杭州湾医院实验室完成。细胞实验纳入标准：（1）实验用的细胞为对数增殖期细胞；（2）细胞转染时，Fam-NC验证CRC细胞株HT-29的转染效率，当转染效率＞50%时可用于后续实验；（3）HT-29细胞使用HieffTransTMLiposomal Transfection Reagent脂质体核酸转染试剂转染6孔板细胞效果最好的阳性比例为70%～80%。

1.2.1 细胞培养及转染 复苏HT-29细胞并调整好细胞状态。提前1d铺板，按3×105个/ml接种到6孔板中，分成两组，每组铺3个孔。37℃培养过夜，使细胞密度达到70%～80%；第2天分别将5μl Hieff脂质体核酸转染试剂、总量为100pmol的siRNA转染至miRNA-455-5pinhibitor（抑制剂组）、miRNA-455-5p-mimics（模拟剂组）、miRNA-455-5p-mimics-NC（模拟剂对照组）、miRNA-455-5p-inhibitor-NC（抑制剂对照组）以及Fam-NC（阳性对照组）的细胞株中，48h后收集细胞，见图1。HT-29细胞培养条件：McCOY’s 5A+10%胎牛血清+1%pen-strep（optional）；0.05%Trypsin 消化 1～2min；1∶2传代，约2d长满；3d左右传代1次。

图1 HT-29 细胞转染结果（a：空白对照组；b：模拟剂组；c：阳性对照组；d：模拟剂对照组；e：抑制剂组；f：抑制剂对照组）

1.2.2 PIK3R1、AKT1、MTOR mRNA表达的检测 采用qRT-PCR法。将收集的细胞沉淀反转录到cDNA，用sybr染料法进行 PIK3R1、AKT1、MTOR mRNA 表达的检测。（1）RNA抽提：对样本进行组织研磨、贴壁细胞洗涤、悬浮细胞去培养基等处理后，置于RNaseFree的1.5ml离心管中；加入1 000μl Trizol试剂，剧烈摇晃，静置5min；加200μl氯仿，振荡混匀，室温静置5min；12 000g、4℃离心15min；将上清液转移至新的1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，室温静置10min；12 000g、4℃离心10min；弃上清液，除尽异丙醇，加入1 000μl 75%无水乙醇，12 000g、4℃离心 5min；弃上清液，待沉淀干燥后加入DEPC处理水30～50μl；RNA电泳和OD检测质检。（2）引物合成：miRNA-455-5p、PIK3R1、AKT1及MTOR合成的引物序列，见表1。（3）调整RNA浓度，按照实验目的稀释RNA至统一浓度；取一灭菌的无RNA酶的eppendorf管，每个样本加入以下组分，得到MixⅠ共 20μl体系：5μg 总 RNA 5μl，rimer（50μM oligo dT） 0.5μl，andom primer 0.5μl，0mM dNTP Mix 1μl，EPC-treated water 5μl；在 MixⅠ里加入以下成分，得到MixⅡ共 20μl体系：5xFirst-Strand buffer 4μl，0.1M dTT 2μl，Naseout（40U/μl）1μl，SuperScripⅢ RT（200U/μl）1μl，MixⅠ12μl。反应条件：25℃ 5min，50℃ 60min，70℃15min。（4）将获得的引物与cDNA模板进行扩增，反应体系：ddH2O 23μl，10×PCR Buffer 2.0μl，Mg2+（50mM）2.0μl，dNTPs（10mM）0.5μl，Primer F（10μM）0.5μl，SYBR（20×）1.0μl，Primer R（10μM）0.5μl，Taq enzyme（5U/μl）0.2μl，Template 1.0μl，总体积 20μl。每个样本反应总量20μl，反应条件：95℃ 2min，95℃ 10s，60℃ 60s，70℃45s，共40个循环；Melt（70～95℃）。采用2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达量，ΔΔCt=待测样品（Ct目-Ct内）-对照样品（Ct目-Ct内）。

1.2.3 PIK3R1、AKT1、MTOR蛋白表达的检测 采用免疫印迹试验。收集模拟剂组、模拟剂对照组、抑制剂组、抑制剂对照组转染48h后的细胞沉淀，裂解、抽提蛋白、蛋白定量、上样检测。具体步骤如下：BCA法测定样品浓度，40μg上样；聚丙烯酰胺凝胶90V跑完积层胶后，将电压升至200V直到电泳结束。取下凝胶，恒压100V、恒流250mA转膜约1.5h；取膜，PBST洗涤4次，5min/次。将膜置于5%脱脂奶粉封闭液中，37℃封闭 1h；用封闭液稀释一抗，膜在一抗稀释液中4℃过夜。次日取出膜，PBST洗膜4次，5min/次。用含5%牛奶的封闭液稀释二抗，膜在二抗中37℃反应1h。取出膜，置于干净的盒子中洗膜4次，5min/次。最后ECL显影，曝光。利用Image J软件计算灰度值，即蛋白相对表达量。

表1 miRNA-455-5p、PIK3R1、AKT1及MTOR合成的引物序列

1.2.4 miRNA-455-5p的PIK3R1靶基因验证 采用双荧光素酶报告基因实验。构建PIK3R1的3′非编码区（3′UTR）报告载体（包括野生型和突变型载体），测序验证正确后小抽制备质粒。将miRNA-455-5p的启动子序列与PIK3R1的3′UTR插入到荧光素酶表达序列前方，构成报告基因质粒，若此转录因子能激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转入因子的作用强度成正比。提前1d铺板，293细胞按8×104个/ml接种到24孔板中，分成5组[空白对照组、阳性对照组（阳性对照质粒pds162）、wt-455-5P-mimic组（CL1011-1-PDS162_psicheck3-gluc-_PIK3R1-3′UTRWT_-fluc）、wt-mimics-NC组（CL1011-1-PDS162_psicheck3-gluc-_PIK3R1-3′UTR-WT_-fluc）]，每组铺 3 个孔。37℃培养过夜，使细胞密度达到70%～80%。第2天分别以脂质体核酸转染试剂 2.3μl、DNA 0.8μg+sirna 30pmol转染细胞48h，收集上清液进行分泌型荧光素酶（Gluc）检测，裂解细胞沉淀进行非分泌型荧光素酶（Fluc）检测，计算Gluc/Fluc值。

1.3 统计学处理 采用SPSS 21.0统计软件。计量资料用表示，两组比较采用两独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miRNA-455-5p 上下调后 PIK3R1、AKT1、MTOR mRNA相对表达量比较 与模拟剂对照组比较，模拟剂组PIK3R1、AKT1、MTOR mRNA相对表达量均明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与抑制剂对照组比较，抑制剂组PIK3R1、AKT1、MTOR mRNA相对表达量均明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表2。

表2 miRNA-455-5p上下调后PIK3R1、AKT1、MTOR mRNA相对表达量比较

2.2 miRNA-455-5p 上下调后 PIK3R1、AKT1、MTOR蛋白相对表达量比较 与模拟剂对照组比较，模拟剂组PIK3R1、AKT1、MTOR蛋白相对表达量均明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与抑制剂对照组比较，抑制剂组PIK3R1、AKT1、MTOR蛋白相对表达量均明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图2和表3。

2.3 双荧光素酶报告基因实验验证靶基因 构建PIK3R1的3′UTR报告载体（包括野生型和突变型载体）：CL1011-1-PDS162_psicheck3-gluc-_PIK3R1-3′UTRWT_-fluc;CL1011-2-PDS162_psicheck3-gluc-_PIK3R1-3′UTR_-MUT-fluc，结果测序验证正确，见表4。本实验荧光素酶切位点位于XhoⅠ/NotⅠ，见图3。转染293细胞48h后，阳性对照组、wt-455-5P-mimic组、wt-mimics-NC组、mut-455-5p-micmics组、mut-mimics-NC组Gluc/Fluc 值分别为 11.52±0.38、5.66±0.16、9.42±0.36、9.10±0.35、9.42±0.36，其中 wt-455-5P-mimic 组明显低于 wt-mimics-NC 组（P＜0.05），见图 4；说明 hsa-miRNA-455-5p能与PIK3R1基因的3′UTR结合，降低PIK3R1蛋白的翻译水平。

图2 miRNA-455-5p上下调后PIK3R1、AKT1、MTOR蛋白表达的电泳图

表3 miRNA-455-5p 上下调后 PIK3R1、AKT1、MTOR蛋白相对表达量比较

表4 PIK3R1的3'UTR报告载体测序结果

3 讨论

图3 双荧光素酶骨架载体信息（PDS162_psicheck3-gluc-fluc，5 882bp；荧光素酶切位点位于XhoⅠ/NotⅠ）

图4 双荧光素酶报告基因实验检测结果（Y1：wt-455-5P-mimic组；Y2：wt-mimics-NC 组；Y3：mut-455-5p-micmics组；Y4：mutmimics-NC 组；*P＜0.05）

miRNA是一类内源基因编码的非编码单链RNA分子，在动植物中参与转录后基因表达上午调控[4]。miRNA参与生命过程中重要进程，包括早期发育、细胞增殖、细胞凋亡、细胞死亡、脂肪代谢以及细胞分化等[12]。目前对miRNA的研究还处于初级阶段，它在高级真核生物体内对基因表达的调控作用，可能与转录因子一样重要，可能代表在一个新发现的层次上的基因表达调控方式[13]。但是miRNA的多数功能仍是个谜。miRNA-RISC对靶基因mRNA的作用主要取决于它与靶基因转录体序列互补的程度，主要有以下3种作用方式[14]：（1）切断靶基因的mRNA分子。miRNA与靶基因完全互补结合，最后切割靶mRNA。在植物中，大部分miRNA采用这种方式进行调控。（2）抑制靶基因的翻译。作用时与靶基因不完全互补结合，进而抑制翻译而不影响mRNA的稳定性，此类miRNA是目前发现最多的。但在植物中极少数miRNA通过此方式来抑制靶基因。（3）结合抑制。具有以上2种作用模式，当与靶基因互补结合时，直接靶向切割mRNA；当与靶基因不完全结合时，起着调节基因表达的作用。生物信息学数据显示，每个miRNA可以调节数百个靶基因，这表明miRNA可能影响所有的信号途径。最近有证据表明，miRNA突变或异位表达与人类多种癌症相关，miRNA可以起到肿瘤抑制基因或癌基因的功能，miRNA可以抑制重要的肿瘤相关基因的表达，可能在癌症的诊断和治疗中起着重要作用[15-16]。如何精确鉴定miRNA所调节的靶基因是目前所存在的挑战之一。由于miRNA和其结合位点并不是完全互补的，可以存在短的错配和G-U配对。因此，利用简单的BLAST确定其靶基因是不可能的。但是，最近的生物信息学手段开始利用同一家族的成熟miRNA在5′末端具有高度的同源性这一特点。因此，大多数生物信息学算法利用一个包含了成熟miRNA的2～8位的3′UTR的互补序列。现单个基因的3′UTR具有几个miRNA的结合位点，这表明miRNA调控基因表达存在着复杂的组合模式。由于miRNA可能调节数个信号通路，这些miRNA的缺失或异常表达可能与疾病相关，包括肿瘤[17]。

最近研究发现，miRNA-455-5p在多种肿瘤中以抑癌基因低表达状态的形式存在[18-20]，但关于它在CRC的研究并不多见。Yang等[21]研究表明，miRNA-455-5p是作用于靶基因galectin-9在结肠癌中发挥靶向调控作用。笔者前期对miRNA-455-5p在CRC中的表达及生物学特性进行了研究，结果表明CRC组织miRNA-455-5p相对表达量低于癌旁正常黏膜组织；在经转染后的CRC细胞中，上调miRNA-455-5p可抑制CRC细胞增殖和迁移，促进细胞凋亡，并通过靶基因预测软件预测了PIK3R1是miRNA-455-5p的靶基因之一[11]。这表明miRNA-455-5p发挥抑癌基因的作用机制可能与调控PIK3R1基因的表达有关[19]。本研究则关于miRNA-455-5p对人结肠癌HT-29细胞株PIK3R1基因靶向调控的作用进行了研究，采用双荧光素酶报告基因实验验证miRNA-455-5p的靶基因。PI3K分为3类，其结构和功能各异。其中研究最广泛的是Ⅰ类PI3K，它是异源二聚体，由1个调节亚基和1个催化亚基组成，该亚基通常称为p85，含有SH2和SH3结构域，与相应结合位点的靶蛋白相互作用。而PIK3R1则是PI3K调节亚基p85α，各种信号分子通过与p85α亚基的结合后才能激活PI3K[22-23]。AKT是一类AGC家族的丝氨酸/苏氨酸激酶，它是PI3K下游的主要效应分子之一，主要通过直接磷酸化多个转录因子而发挥作用。PI3K/AKT信号通路参与调控下游多个转录因子（如AKT、Mtor、XIAP等），在肿瘤的发生、发展过程中起重要作用[24]。

本研究检测了miRNA-455-5p上下调后PIK3R1 mRNA和蛋白的表达情况，结果表明：抑制miRNA-455-5p后，能促进HT-29细胞PIK3R1、AKT1、MTOR mRNA及蛋白表达；与模拟剂对照组比较，上调miRNA-455-5p 能抑制 HT-29 细胞 PIK3R1、AKT1、MTOR mRNA及蛋白表达；这说明miRNA-455-5p上下调对PI3K/AKT信号通路具有抑制和激活作用，也说明了miRNA-455-5p是通过PIK3R1基因起调控作用的，PIK3R1可能是miRNA-455-5p的靶基因之一。双荧光素酶报告基因系统是以荧光素为底物来检测萤火虫荧光素酶活性的一种报告系统。通过荧光测定仪测定荧光素氧化过程中释放的生物荧光，可以灵敏、高效地检测基因的表达，是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。本研究采用双荧光素酶报告基因检测法分析转录因子miRNA-455-5p与PIK3R1基因启动子区DNA的相互作用，结果表明：hsa-miRNA-455-5p 与 psicheck3-gluc-_PIK3R1-3′UTR-WT_-fluc共转染293细胞48h后检测的Gluc/Fluc值与 mimics-N与 psicheck3-gluc-_PIK3R1-3′UTR-WT_-fluc共转染48h后比较明显降低，这说明hsa-miRNA-455-5p能与PIK3R1基因的3′UTR结合，降低PIK3R1蛋白的翻译水平，即验证了PIK3R1是miRNA-455-5p的靶基因。

综上所述，miRNA-455-5p对人结肠癌HT-29细胞株PIK3R1基因具有负向调控作用，PIK3R1基因是miRNA-455-5p调控的靶基因。而miRNA-455-5p是如何通过靶基因PIK3R1在PI3K/AKT信号通路中影响肿瘤细胞的增殖、凋亡及转移的机制，有待进一步研究。