曹 倩，李 兰，邹 莹，李云川，李 勇，龙俊君，刘浩文，何柳余，田二苗

（昆明市第一人民医院眼科，云南昆明 650032）

我国有大量的角膜盲患者，角膜移植术是其唯一的复明方式。目前，我国心脏死亡供体捐献（donation after cardiac death，DCD）角膜是角膜移植植片的主要来源[1]。而角膜移植术后免疫排斥仍是手术失败的主要原因[2-3]，因此角膜移植术后排斥反应的防治成为角膜移植领域研究的热点。既往制备心脏死亡供体的动物实验方法包括注射氯化钾、麻醉+呼吸机撤除（窒息）、放血以及电击诱导心脏骤停等。这些方法或可能存在药物因素影响，或提前产生器官的缺血损伤，或与临床DCD供者的死亡模式差异较大，难以模拟临床实际情况[4]。大鼠由于角膜MHC抗原的表达与人类角膜相似，实验抗原购买方便，相比其他实验动物价格低，且比小鼠角膜移植难度低，眼科研究中常用大鼠眼球做动物模型[5]。目前大鼠角膜移植动物模型多是参考Williams的方法[6]。本实验参考了既往实验的基本方法，对一些造模细节有所改进及创新，总结了影响心脏死亡大鼠供体角膜移植排斥模型建立的关键步骤及注意事项，供实验参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 成年雌性SD大鼠，体重220～250 g，无眼部疾患[由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK（湘）2019-0004]均取右眼作为手术眼，保留左侧正常眼不影响大鼠术后进食。实验动物的使用和喂养遵循国家科学技术委员会颁布的《实验动物管理条例》[7]。

1.1.2 主要试验试剂及仪器设备 主要试剂：10%水合氯醛、0.9%生理盐水、聚维酮碘、Optisol角膜保存液、庆大霉素注射液、妥布霉素眼膏。

主要设备：体视显微镜、角膜移植手术器械、维纳斯剪。

1.2 方法

50只成年雌性SD大鼠按照随机数字表随机分为供体组（10只，20眼）、实验组（同种异体角膜移植组20只，20眼）、对照组（自体角膜移植组20只，20眼）。

1.2.1 供体准备 供体植片准备：成年雌性SD大鼠，体重220～250 g，使用5 mL注射器抽取5 mL空气，戴棉线手套固定好大鼠头部及尾部，防止抓伤。于大鼠左侧肋骨角偏左上方心脏方向处进针，回抽见血液确定穿刺部位位于心腔，注射5 mL空气处死SD大鼠，从而建立心脏死亡模型。将大鼠左侧卧位，头部固定于自制的大鼠头部固定枕上，见图1A、图1B，使眼部处于与手术台平行位置。术前使用5%～10%聚维酮碘消毒结膜囊3 min以上[8]，0.9%生理盐水再次冲洗结膜囊。显微有齿镊固定9点方向角膜巩膜缘，使眼球呈轻度脱臼状态。1 mL注射器于3点方向穿刺入前房，维纳斯剪顺着穿刺点进入前房沿角膜缘360°剪下全层角膜供体。将供体角膜上皮面朝上放于4.25 mm环钻台中央铺好后，将环钻压于环钻台上制作植片，植片制作完毕后置于Optisol保护液中备用。

1.2.2 同种异体角膜移植（实验组）采用10%水合氯醛3 mL/kg行大鼠腹腔麻醉，麻醉生效后同供体准备方法，维纳斯剪顺着穿刺点进入前房沿角膜缘360°剪下4.0 mm受体角膜植片（可用液氮保存），制作好植床。将供体植片置于受体植床上，见图2A，使用12-0国产显微缝线进行间断缝合8针，线节不埋藏，前房内注入空气约0.1mL形成前房，见图2B。术毕，结膜下注射庆大霉素注射液0.1 mL，结膜囊内点妥布霉素眼膏，6-0缝线缝合眼睑中部防止术后大鼠抓挠眼部引起感染。

1.2.3 自体角膜移植（对照组）采用10%水合氯醛3 mL/kg行大鼠腹腔麻醉，麻醉生效后操作同供体准备方法，维纳斯剪顺着穿刺点进入前房沿角膜缘360°剪下4.25 mm角膜植片，旋转180°后，见图3A，使用12-0国产显微缝线进行间断缝合8针，线节不埋藏，其他处理同同种异体角膜移植，见图3B。

图3 同种自体角膜移植Fig.3 Autologous corneal transplantation

1.2.4 术后处理 术后24 h剪开眼睑缝线，点妥布霉素眼膏，1次/d。术后体式显微镜下观察并拍照。建模成功标准：术后3 d内无植片伤口裂开，无前房、眼内感染等并发症发生；术后1周内每日观察1次，1周后隔日观察1次，并记录角膜植片的混浊指数、水肿指数及新生血管指数并评分，直至术后14 d取材。

按照Larkin DF[9]的标准，由同一医生进行排斥反应评分，三项评分之和为排斥指数（rejection index，RI），当RI≥6，确定为排斥，见表1。

1.3 统计学处理

使用SPSS软件对结果进行统计学分析。统计实验组、对照组大鼠术后14 d排斥反应评分，计量资料用（）表示，用t检验。差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 角膜移植术后排斥反应评分标准Tab.1 Scoring criteria for rejection after corneal transplantation

2 结果

2.1 角膜植片观察

实验组（同种异体角膜移植组）排斥反应率较对照组（自体角膜移植组）显著增高。

实验组：共20只大鼠，1只大鼠于术后1 d死亡，其余19只大鼠术后第1～3天角膜植片轻度混浊、基质水肿，第6～7天切口处出现新生血管，后向植片中心生长，植片混浊、基质水肿逐渐加重，术后14 d取材，术眼均发生排斥反应，排斥反应指数均≥6。评分7分（植片混浊度分4分+植片水肿度2分+植片新生血管度1分=7分），见图4。排斥反应率为100%。对照组共20只大鼠，术后第1～3天角膜植片轻度混浊、基质水肿，第6～7天混浊及水肿逐渐消退，术后第14天取材，术眼植片未出现新生血管，排斥反应指数均＜6。

2.2 实验组、对照组术后7 d、14 d角膜植片评分

实验组、对照组大鼠角膜移植术后7 d、14 d植片评分情况，术后7 d排斥反应评分实验组为（4.5±0.65）分，对照组为（4.0±0.25）分，差异无统计学意义（t=1.966，P=0.077 6），术后14 d排斥反应评分实验组为（8.5±2.12），对照组为（3.0±0.32）分经t检验，差异有统计学意义（t=3.871，P=0.0045），见表2。

2.3 实验组、对照组术后排斥反应指数对比

实验组术后8 d左右开始出现排斥反应，持续时间长、排斥反应重。术后14 d取材，实验组排斥反应评分为（8.5±2.12）分，对照组排斥反应评分为（3.0±0.32）分，经t检验，P=0.004 5，差异有显著统计学意义，见图5。

图4 实验组大鼠术眼角膜植片排斥图Fig.4 Exclusion of corneal grafts in rats

表2 两组大鼠角膜移植术后7 d、14 d植片评分情况［（），n=20］Tab 2 Rat corneal transplantation in the experimental and control group ［（），n=20］

表2 两组大鼠角膜移植术后7 d、14 d植片评分情况［（），n=20］Tab 2 Rat corneal transplantation in the experimental and control group ［（），n=20］

图5 实验组、对照组术后同时间排斥反应指数折线图Fig.5 The index line diagram of the experimental group and the control group after operation

3 讨论

心脏死亡供体模型多采用小型猪制作，但目前尚无适用于大鼠的心电监测及呼吸机设备可用于实验，亦未见心脏死亡大鼠模型的建立报道。本文采用心腔内注射空气直接造成心脏死亡，参考Williams[6]制作大鼠角膜移植的方法制作大鼠心脏死亡供体角膜移植排斥反应模型，改进了部分造模细节、关键步骤及流程。方法简单易行，可操作性强。

3.1 减少感染

减少感染，保证实验过程无菌条件，缩短手术时间大鼠角膜直径约6 mm，前房极浅，晶体呈球形，角膜移植手术操作难度大，一旦术后发生感染将直接造成模型制作失败，因此保证造模后术眼不感染是最重要的。大鼠角膜移植过程中眼内容物虹膜晶体等暴露的时间越长，术后感染几率越大，动物实验过程中需严格无菌操作以减少术后感染发生的几率。大鼠颅骨解剖特点决定了实验时眼部无法与试验台保持平行，视野聚焦不清楚，会增加眼内容物脱出的风险，本实验中研究小组自制的大鼠头枕可以将大鼠头部固定牢固且保证眼位，为手术创造适宜条件，缩短大鼠眼部“开窗”时间，从而减少术后眼内炎发生几率。同时锐利的手术器械和熟练的操作对于缩短手术时间也非常重要。受体麻醉剂的选择，目前多选择使用3%戊巴比妥1.5 mL/kg或10%水合氯醛3.5～4.2 mL/kg[10-11]。本研究选择10%水合氯醛3 mL/kg进行腹腔麻醉，麻醉效果及麻醉深度好，能保证角膜移植手术顺利进行。首都医科大学基础医学院报道了水合氯醛、乌拉坦、戊巴比妥三种常用麻醉剂对长爪沙鼠麻醉效果观察，发现水合氯醛与戊巴比妥比较，麻醉期较长、诱导期更短，对心跳呼吸频率影响更小[12]。

3.2 增加角膜移植排斥几率

本实验中角膜移植排斥几率为100%。影响人眼角膜移植排斥的因素有：受体原发角膜病变，是否为再次角膜移植，是否为高危角膜移植，角膜植片大小[13-14]。大鼠模型中可控因素为植片大小、缝线、术后处理。植片大小的选择文献报道大部分为3 mm[15]。应根据实验目的选择植片大小，如果实验目的为获取排斥角膜植片进一步研究则可选4.25 mm直径环钻，因为角膜植片越大，术后排斥反应几率越大，4.25 mm直径植片标本体积大，也更利于进一步分析。大部分文献显示缝线选择10-0缝线[16]本文中使用国产12-0尼龙线，对比进口10-0缝线而言，粗细、韧度相当，针尾较10-0缝线粗，优势是价格为进口缝线的1/20。本研究术后使用妥布霉素眼膏，术后未发生眼内炎，术后10d左右开始出现排斥反应。既往研究中有使用抗生素眼液+糖皮质激素眼膏方案[17]，但具体频次尚无统一标准。本研究中术后每日使用妥布霉素眼膏，操作次数减少，在保证动物模型成功的前提下减少了工作量，术后使用糖皮质激素眼膏可以降低排斥反应发生率，为增加术后排斥反应率可不必使用糖皮质激素眼膏，仅用抗生素眼膏，术后14 d可出现明显排斥反应。

综上所述，心脏死亡大鼠角膜移植排斥反应模型制作的关键步骤为：固定大鼠头位、麻醉剂的选择、锐利的手术器械及熟练的显微手术操作技巧，保证在尽可能短的时间内完成手术，减少术后感染发生率；选择直径4.25 mm大小植片、12-0国产尼龙缝线（价格低廉）、术后仅使用抗生素眼膏预防感染。